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DNA 序列测定

DNA 序列测定. 末端终止法 -- 待测单链 DNA 模板 引物 四种 dNTP( 其中一种用 32 P/ 35 S 标记 ) 终止剂 (ddNTP) DNA 聚合酶 Sanger 发明：两次获得 诺贝尔奖 分别得到 ddA ddT ddG ddC 结尾的片段. 测序过程 : 1. 模板与引物杂交 2. 引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA 聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链

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Presentation Transcript

  1. DNA序列测定 • 末端终止法--待测单链DNA 模板 引物 四种dNTP(其中一种用32P/35S标记) 终止剂(ddNTP) DNA聚合酶 • Sanger发明：两次获得诺贝尔奖 • 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段

  2. 测序过程: • 1.模板与引物杂交 • 2.引物的延长和合成阻断 • 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 • 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT • 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 • 3.电泳 ACGT次序 高压电泳 • 4.放射自显影得到直读图象

  3. 第十章 核酸分子杂交技术 • 概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 • 探针 待测核酸 杂交分子 • 核酸分子杂交的基本原理 • 核酸分子杂交的基本方法 • 探针的标记

  4. 核酸分子杂交的基本原理 • DNA变性 • 方法 • 热变性：90~100℃ • 酸碱变性：常采用碱变性 • 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 • 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm) • DNA复性或杂交(hybridization) • DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等

  5. 影响杂交的因素 • 核酸分子的浓度和长度 • 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 • 温度 • 离子强度 • 杂交液中的甲酰胺 • 核酸分子的复杂性 • 非特异性杂交反应 • 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA

  6. 分子杂交的基本方法 • Southern 印迹法 • Northern 印迹法 • 斑点印迹杂交 • 原位杂交 • Western 印迹法 • 液相杂交

  7. A B C M bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237

  8. Southern 印迹杂交 • 1975年，英国Southern创建 • DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。

  9. Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 • 待测DNA样品的制备、酶切 • 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 • 凝胶中DNA的变性：碱变性 • Southern转膜： • 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 • 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 • 探针的制备 • Southern杂交 • 杂交结果的检测

  10. Northern 印迹杂交(Northern bloting) • 检测RNA（主要是mRNA）的方法 • 与Southern杂交的不同 • 靶核酸：RNA • RNA电泳 • 转膜：不需变性

  11. 斑点印迹杂交(dot bloting) • 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 • 优点：简单、快速、可同时检测多个样品

  12. 原位杂交(in situ hybridization) • 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 • 特点 • 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 • 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 • 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态

  13. 核酸原位杂交的基本步骤 • 细胞或组织的固定：载玻片 • 组织细胞杂交前的预处理 • 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 • 探针的选择和标记 • 杂交 • 杂交结果检测

  14. Western杂交印迹法(Western bloting) • 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 • 主要步骤： • 蛋白质样品的制备 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 • 蛋白质的电转移：NC膜 • 靶蛋白的免疫学检测 • 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 • 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 • 显色反应：酶促反应

  15. 液相杂交 • 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中 • RNA酶保护分析法 • 核酸酶S1保护分析法

  16. 探针的标记 • 探针的种类 • cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针 • 标记物 • 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 • 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等

  17. 探针标记方法 • 缺口平移法(nick translation) • 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物 • PCR标记法 • 末端标记法 • 探针的纯化

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