1 / 26

ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения

ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения. Орехов В.А. ООО “ ГОРДИЗ ”. 31 января 2013 г. г. Звенигород. Применяется с середины 90-х годов.

pascha
Download Presentation

ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения Орехов В.А.ООО “ГОРДИЗ” 31 января 2013 г.г. Звенигород

  2. Применяется с середины 90-х годов. В последнее время повышенный интерес, публикации, монографии:- Типирование нечеловеческой ДНК (Coyle, 2008) - Судебная микробиология (Budowle, 2011) - Рекомендации ISFG (2011) «Нечеловеческая» ДНК в экспертной практике

  3. Россия занимает 2 место в мире после США по числу домашних животных на душу населения: 33% семей содержат кошек (25-30 млн. кошек), 20% семей содержат собак (20 млн. собак). При проникновении в помещение с домашним животным неизбежна «контаминация» шерстью (D’Andrea, 1998) -> возможность привязки к месту преступления либо хозяину животного (мтДНК, реже STR). Домашние животные:свидетели, нарушители, жертвы Животные-нарушители:нападения на людей -> доказательство виновности или невиновности (Австралия: 4 миллиона собак, ~ 100 000 нападений на людей, большинство не раскрыто) Животные-жертвы: случаи жестокого обращения с животными

  4. Охарактеризовано > 30кандидатныхSTR-маркеров (три-, тетра-, пента- гекса-, Tom 2010; Berger, 2008; van Asch 2008). Опубликованы мультиплексы: DogFiler – 16 локусов (Wictum, 2013) Mini-DogFiler 3 мультиплекса с мини STR(Kun, 2013) Работают на волках, лисах, койотах Домашние животные: собаки Иерусалим- c 2012 база данных Генотипирование экскрементовШтраф > 100 USD Премия – упаковка корма Ранее в Петах-Тикве.

  5. Охарактеризовано 49 кандидатных STR-маркеров (Menotti-Raymond, 1999, 2005) Предложена стандартная панель из 11 локусов. Реализовано – MeowPlex (Butler, 2002). Домашние животные: кошки MewPlex: 11 STR + SRYPD = 5,5 X 107 - 3,3 X 1013

  6. Связь с подозреваемого или жертвы с местом преступления через следы растений. Возможно при условии уникального видового состава растительности. • 1993 год – два семени дерева Parkinsoniaaculeata с места преступления в багажнике пикапа подозреваемого – доказательство вины. (Yoon, 1993) Судебная ботаника 2. Географическое происхождение наркотиков (марихуана) Возможность отследить связь пользователя с дилером и производителем. Типирование высокополиморфных STR-маркеровпозволяет различить даже инбредные линии. Возможен анализ смесей. (Hsieh, 2003). Возможно создание базы данных.

  7. Судебная ботаника Шалфей предсказателей Salvia divinorum 15 STR multiplex PCR -Cannabis species Австралия, база данных (Howard, 2008)

  8. Идентификация биологических следов. Бактерии Lactobacillus crispatusи Lactobacillus gasseri специфичны для вагинальных секретов– возможность идентификации вагинальных выделений. Менструальное происхождение крови. Streptococcus – обнаруживаются только в ротовой полости человека – слюна, отличить кровь из ротовой полости от другой крови (Donaldson, 2010) Видовой состав бактерий и грибов почвы, найденной на одежде или обуви может дать привязку к конкретной местности. Биотероризм. Октябрь 2001 –атака на правительственные учреждения США. 22 почтовых конверта с сибирской язвой -> 5 человек погибло. 125 000 конвертов были протестированы на отсутствие сибирской язвы. ФБР – рабочая гурппа по судебной микробиологии (Budowle) Личинки насекомых Diptera – привязка трупа к месту преступления. Определение давности трупа по стадии развития личинок. Судебная микробиология и энтомология

  9. Идентификация останков неизвестного происхождения (фрагменты костей). Человек или животное? • Незаконная торговля редкими и исчизающими видами (годовой оборот 20 млрд.$ в год). • Агрессия диких животных (нападение на людей, домашних животных). • Случаи незаконной охоты на диких животных. Анализ видовой принадлежности животных

  10. Секвенирование участка мтДНК • мтДНК - Контрольный регион– не пригоден, высокая внутривидовая изменчивость • мтДНКген Цитохромаb- наиболее удобен для идентификации видов позвоночных (Parson, 2000), позволяет дискриминировать даже близкие виды • мтДНК – ген 12S рРНК– слишком консервативен. Информативно ~150 bp • мтДНК – ген COI – консервативен, выбран проектом Barcode of life648 bp Этапы анализа видовой принадлежности 2. Анализ последовательности мтДНК: - Сравнение с референсными образцами; - Поиск гомологии в GeneBank; - Сравнение с референсной базой данных (Barcode of life)

  11. Рекомендация ISFG – параллельно с исследуемыми образцами анализировать референсные образцы из надежного источника. Последовательности выравниваются • Проводится филогенетический анализ Сравнение с референсными образцами

  12. Последовательности загружаются в Blast:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Поиск максимальной гомологии в базе GeneBank GeneBank- Нереферируемая база данных, может содержать ошибки Поиск гомологии в GeneBank

  13. Мишень: участок контрольного региона мтДНК –> высокий межвидовой полиморфизм по длине. Высокая чувствительность. Универсальный набор для всех млекопитающих. Применение: анализ неопознанных останков, преступления против дикой природы, смешанные образцы Человек Фрагментрый анализ мтДНК определение видовой принадлежности Собака Бурый медведь Nakamura et al. Int J Legal Med (2009) 123:177–184

  14. 3. Автоматизированный анализ в специализированных базах данных. BOLD - Barcode Of LifeDatabase - http://www.boldsystems.org/ Задача проекта – создание наиболее полного каталога всех видов планеты. Используется участок 648 bp гена COI. Сравнение с референсной базой BOLD Собрано видов (2012): животных:114 098 растений: 39 730 грибов и др. 2 366

  15. 8 тетрануклеотидных маркеров для идентификации 10 видов лососевых Идентификация лососевых – микросателлитные маркеры Животовский Л.А., Шайхаев Е.Г., Шитова М.В. 2013, Биология моря

  16. Гибриды кеты и горбуши (Курильский ЛРЗ, 2011г.) OMM1050 – идентификация гибридов лососевых Кижуч Кета Гибриды Горбуша М - Маркер молекулярной массы 1, 2 – Горбуша , 139 п.н. 3, 4 – Кета, 155 п.н. 5, 6 – Гибрид горбуши и кеты, 139, 155 п.н. 7, 8 – Кижуч, 160,164 п.н.

  17. Методы, используемые для анализа ДНК человека: ДНК- идентификация животных Оптимальная схема анализа: 1) Определение видовой принадлежности с помощью секвенирования мтДНК 2) Идентификация особи с использованием STR-маркеров. Если нет информации о последовательностях – секвенирование мтДНК.

  18. Дело по факту незаконной охоты на диких животных (п. а ч.1 ст. 258 УК РФ): • 326 образцов: • 283 образца мышечной ткани; • 4 образца волос с луковицами; • 3 образца шкур (один лось, два бурых медведя); • 36 образцов, собранных с вещественных доказательств (перчатки, топор, смывы с вездехода и т.д.) • Задача: • Определить видовую принадлежность образцов, изъятых при осмотрах мест происшествий; • Определить количество особей, которым принадлежат изъятые образцы; • Сравнить генотипы особей с генотипами на вещественных доказательствах • Работа проводилась совместно с • ООО «Центр Молекулярной Генетики», МГНЦ РАМН Случай незаконной охоты на диких животных

  19. Контрольные референсные образцы • в соответствии с рекомендациями ISFG: • 10 образцов бурого медведя (Ursusarctos) • 10 образцов лося (Alcesalces) • предоставлены Институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН • Определение видовой принадлежности: • анализ нуклеотидной последовательности участка гена цитохромаbмтДНКпозиции 1 - 402 п.н.; • филогенетический анализ полученных последовательностей с привлечением референсных образцов; • поиск гомологии в GeneBank для образцов, не кластеризующихся с референсными образцами. Стратегия исследования и выбор маркеров

  20. При анализе нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b выявлены гаплотипыследующих видов: • лось (Alces alces) - 274 образца ; • бурый медведь (Ursus arctos) - 18 образцов; • - дикий кабан или домашняя свинья (Sus scrofa) - 1 образец ; • корова (Bos taurus) – 3 образца; • человек (Homo sapiens) – 6 образцов Результаты анализа видовой принадлежности В кластерах с референсными образцами Определялись через Blast Выравнивание Сиквенс Дерево

  21. - Один вид (Susscrofa); • - Неразличимы на основе нуклеотидных последовательностей мтДНК гена цитохром b; Sus scrofaдикий кабан или домашняя свинья

  22. Animaltype Pig – 11 STR + маркер пола

  23. Нуклеотидная последовательность генома неизвестна. • Описаны только динуклеотидные маркеры. • Создан мультиплекс из 7 маркеров: Бурый медведь (Ursus arctos) выбор маркеров Andreassenet al., 2012, 13 динуклеотидных маркеров

  24. Полиморфизм вида Alcesalces в Россииисследован слабо. • Обычно адаптируются маркеры, описанные для коровы Bostaurus (разные семейства) -> низкополиморфные маркеры. • Создан мультиплекс: • 4 высокополиморфныхдинуклеотидныхSTR-маркера и маркер пола, • Cervid 1 оказался мономорфным Лось (Alces alces) - выбор маркеров

  25. Бурый медведь (Ursusarctos) • - 10 разных генотипов в 10 референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации; • в исследованных 18 образцах выявлено2 генотипа (т.е. минимум 2 особи); • в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения. Результаты STR-типирования • лось (Alcesalces) • - 10 разных генотипов в 10 референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации; • в исследованных 268 образцах выявлено9 генотипов (т.е. минимум 9 особей); • в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения.

  26. Спасибо за внимание! Владимир Орехов ООО “ГОРДИЗ” orekhov@gordiz.ru моб: +7 (495) 799-38-72 офис: +7(495) 988-02-94 www.gordiz.ru

More Related