基因诊断与基因治疗

基因诊断 与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 主讲：李志红

第一节基因诊断Gene Diagnosis

基因诊断 性状基因蛋白质基因诊断生化诊断临床诊断

基因诊断的概念和特点 • 定义 • 利用现代分子生物学技术，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 • 特点 • 1．以基因做检查材料和检查目标，针对性强 • 2．分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强 • 3．分子杂交和PCR具有放大效应，故灵敏度高 • 4．适用性强，诊断范围广

、基因诊断的主要对象和样品来源 对象：主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子。样品来源：临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。

核酸抽提 目的序列的扩增分子杂交信号检测二、基因诊断技术基因分型定性分析检测基因突变分类测定基因拷贝数定量分析测定基因表达产物量基本流程：

基因诊断常用技术方法 （一）核酸分子杂交技术（二）聚合酶链式反应（三）基因测序（四）基因芯片

（一）核酸分子杂交技术 • 限制性片断长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP)： • 这种方法对于点突变非常有效。由于基因突变，引起酶切部位的改变，导致限制性片断数目、每个片断长度不同。 e.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断 β珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAG——GTG Glu——Val

已知限制酶Mst 1识别序列（CCTNAGG） • CCTGAGG • CCTGTGG • 突变后不能识别 • 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。

Southern blot

（二）PCR技术 • 巢式PCR • 多重PCR • RT-PCR • 实时PCR • 联合PCR

PCR-单链构象多态性 single strand conformation polymorphism( SSCP)分析 • PCR-SSCP是在PCR技术基础上发展起来的一种简单、快速、经济的显示PCR反应产物中点突变的手段。 • 原理：PCR产物经变性后可以产生2条互补的单链，不同的单链构象不同，如果存在基因突变，哪怕是只要有一个碱基发生改变，单链的构象也发生变化; • 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常与基因突变的DNA单链将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。 • 优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。

（三）基因测序 是最直接、最准确的基因诊断技术病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）。

三、基因诊断的应用 • 遗传疾病 • 肿瘤 • 感染性疾病，传染性流行病 • 判断个体疾病易感性 • 器官移植组织配型 • 法医学中个体识别、亲子鉴定

我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断

基因检测的现状 • 目前可以用基因检测进行检测的疾病数1767种，其中1492种检测应用于临床，275种仅用于研究。 • 美国早在1996年就开始了基因检测，2004年接受检测的人次数递增至400万，占人口比例1.57﹪，至2007年已有700多万人次。 • 国内目前已经开展的基因检测项目包括： • 遗传病基因检测数十种，如遗传病的染色体检测，地中海贫血基因检测，G-6PD基因检测等； • 易感基因型检测400多种，如白细胞抗原（HLA）分型检测、多种癌症、糖尿病、冠心病、心肌梗死、动脉粥样硬化、高血压病、老年性痴呆等；

疾病易感基因检测适合于…... • 家族中有某种疾病的遗传病史者。 • 某类疾病的高风险人群，如近亲或个人罹患慢性疾病，或者常处于污染环境者。 • 有正确健康意识者。

第二节基因治疗Gene Therapy

一、基因治疗的概念 • 定义 • 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病的目的。

20世纪60年代 Edward Tatum提出基因水平上纠正缺陷基因的设想。以病毒为截体，体细胞为靶细胞的技术路线，从根本上解决遗传病的治疗问题。 1966年美国国立实验室的Rogers发现，接触兔乳头状病毒的实验工作人员中相当部分的血精氨酸降低。推测病毒核酸进入细胞使精氨酸酶活性升高。 1973年 Rogers用shope兔乳头状瘤病毒感染一个患有精氨酸血症女孩的皮肤成纤维细胞，使细胞精氨酸酶活性上升，且可持续7个月。 1990年11月，美国NIH的Blease,Culver和Anderson进行了首例人体基因治疗临床试验。患ADA缺失症的4岁小女孩，利用反转录病毒将ADA基因转移到T淋巴细胞中，再回输。患者免疫力明显提高，取得了巨大成功。二、基因治疗历史

基因治疗的三要素：(NIH提出） • 合适的目的基因 • 发病机制在DNA水平上已经清楚 • 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解 • 合适的基因转移方式 • 合适的基因表达与调控

三、基因治疗的基本策略 （一）缺陷基因精确的原位修复基因矫正 gene correction 致病基因的突变碱基进行纠正基因置换 gene replacement 用正常基因通过重组原位替换致病基因这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。

（二）基因增补 不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加（gene augmentation）或称基因增补，是目前临床上使用的主要基因治疗策略。

（三）基因沉默或失活 有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为基因失活（gene inactivation）或基因沉默（gene silencing）。

反义RNA • 定义：与mRNA或其它RNA互补的RNA分子。 • 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合即抑制了该mRNA的翻译，是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中也存在反义RNA。

特点（l）安全性高，专一性强，效率高。反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣” （2）设计和制备方便（3）具有剂量调节效应（4）在治疗RNA病毒感染性疾病时有更大的优势。能直接作用于一些RNA病毒，阻断RNA病毒的繁殖

（四）自杀基因治疗 • 将“自杀基因”导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀效应”，从而清除肿瘤细胞。为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。

自杀基因的旁观者效应 “自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。

（五）基因免疫治疗(基因疫苗) • 定义 • 通过将抗癌免疫增强细胞因子（TNF,干扰素，IL-2)或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。

三、基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择病毒载体非病毒载体基因载体的选择体细胞生殖细胞靶细胞的选择间接体内疗法直接体内疗法基因转移外源基因表达的筛选利用在体中的标记基因回输体内

（一）选择治疗基因 许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建的去除膜结合特征的受体），以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。简言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或经改造的基因作为治疗基因。

（二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。病毒载体：逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关的病毒(AAV)等。非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体。

（三）靶细胞的选择 ---- 分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只限于应用体细胞靶细胞选择的原则: • 1.易操作; • 2.易培养; • 3.易接受外源基因; • 4.在体内能持久高效表达目前常用的靶细胞包括：成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞等

（四）基因转移方法 • 化学方法——磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法 • 物理方法——电穿孔法、粒子轰击法（基因枪） • 病毒法——主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。 • 膜融合法——细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法、微细胞核介导法等

将治疗基因导入人体 • 间接体内疗法 • 目的基因转移到体外培养的靶细胞内高效表达，然后将靶细胞回输体内 • 直接体内疗法 • 将目的基因在体内直接转移到靶细胞 • 载体：需要有特异导向性和高转移效率

ex vivo 靶细胞载体目的基因 in vivo

（五）治疗基因表达的检测 无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。被导入基因的表达状态可以用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导入基因是否整合到基因组以及整合的部位，可以用DNA印迹技术进行分析。

（六）回输体内 方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 • 基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中； • 将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织； • 采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞； • 或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。

腺苷脱氨酶(ADA, Adenosine Deaminase) )缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID, severe combined immunodeficiency syndrome) • 病因 • 淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年 (bubble-baby syndrome; very low T cell counts)

治疗基本步骤: ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状

基因治疗成功范例 • ADA缺乏症基因治疗 • 1990年9月 , 一位四岁的ADA缺乏症女孩接受了首例基因治疗 • 患者注入10亿个遗传修饰的T淋巴细胞, 约每月1次, 连续1年, ADA水平从1%上升到20%, 淋巴细胞数量正常, 免疫功能正常 • 1991年,另一位9岁患者基因治疗也取得成功, 他们从隔离病房走向了美好生活.

四、基因治疗的应用与展望 应用遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病展望进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响

基因治疗展望 展望21世纪, 各种遗传病, 肿瘤外, 传染病，神经系统, 心血管系统和各种常见疾病均可以获得治疗. 基因治疗象吃药和打针一样方便; 按照人和疾病治疗的需要定量表达或关闭基因. 基因治疗可以让人类告别传染病, 肿瘤, 使人长得更高,寿命更长,使人更聪明，更漂亮，使人看得更远，听得更清楚, 生活更加美好.

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