Lab of Developmental Biology

1. Lab of Developmental Biology Hematoxylin & Eosin Stain The Master´s Course 김선미

2. Lab of Developmental Biology 접안렌즈 경통 대물렌즈 경주 재물대 대: 조동나사 집광기 광원 소: 미동나사 경각 광학현미경 • 광학현미경(light microscope, LM) : 빛을 이용하여 물체를 보는 현미경 • 물체의 형상을 보기 위해서 가시광선을 이용 • 얇게 잘라 염색하여 관찰

3. Lab of Developmental Biology 현미경사용법 1. 현미경 이동시에는 반드시 똑바로 세운 상태로 조심해서 운반함. 2. 렌즈에 손이 닿지 않도록 하고 닦을 때는 렌즈페이퍼를 사용함. 3. 현미경 작동이 안될 때 혼자 고치려 하지 말고 조교의 도움을 받는다. 4. 언제나 저배율에서 먼저 관찰을 하고 고배율로 전환한다. 5. 고배율로 고정시킨 상태에서 조대조준장치를 움직일 때는 극히 조심해야 함. 6. 접안렌즈를 통하여 보는 동안에 대물렌즈를 낮추지 말아야 한다. 렌즈와 재물대의 Slide glass가 부딪쳐 깨지기 쉬우므로 경통을 내릴 때는 반드시 옆에서 보면서 작동해야 한다. 7. 대물렌즈 - 피검체에 가까운 렌즈로서 4ⅹ, 10ⅹ, 40ⅹ, 100ⅹ등이 있다. 8. 접안렌즈 –대물렌즈에 의해 생긴 확대상을 확대하는 기능을 하며5ⅹ, 8ⅹ, 10ⅹ, 25ⅹ등이 있다. 9. 조리개 - 반사경에서 렌즈를 보내는 광선의 양을 조절하는 장치 10. 반사경 –광선을 반사하여 렌즈로 보내는 장치 11. 집광기 –재물대 구멍의 중앙에 광선을 집중시키는 장치

4. Lab of Developmental Biology • 고정액 : 부완액, 알코올, 포르말린과 같은 용액 • 고정액의 침투를 쉽게 하기 위해서 조직은 작게 자름. • 조직을 주사위 모양의 정육면체로 가정할 때 한 변의 길이가 5㎜-1㎝를 넘지 않도록 하는 것 1. 고정(fixation) 2. 탈수(dehydration) 3. 투명화(clearing) • 대부분의 고정액은 수용성 • 고정액을 조직에 침투시키기 위해서는 조직내의 물을 제거해야 함. • 탈수는 대개의 경우 알코올을 이용 • 고정죈 조직을 알코올에 담궈 물을 제거하고 알코올로 대체 • 알코올과 파라핀은 섞이지 않음. • 두가지 물질과 친한 물질 필요 : 자일렌(xylene),톨루엔(toluene)등 • 알코올로 대체된 조직을 자일렌에 옮기면 알코올이 빠져 나가고 그 자리를 자일렌이 채우게 됨. (이때 조직이 투명하게 됨.) 광학현미경 표본 제작

5. Lab of Developmental Biology 4. 파라핀 침투와 포매 5. 절편 자르기와 slide glass에 붙이기 6. 파라핀제거(deparaffin) 광학현미경 표본 제작 • 포매(embedding) : 투명화된 조직을 녹은 파라핀 속에 담궈 다시 자일렌을 제거하고 파라핀을 침투 • 완전히 파라핀이 침투한 후 온도를 낮추면 파라핀은 굳게 됨. • 마이크로톰(microtome)을 이용하여 포매된 재료를 얇게 자름. • 잘린 절편을 슬라이드 글라스에 펼쳐 붙임. • 현미경 관찰을 위해서는 염색을 하는데 염색약은 대부분 수용성 • 파라핀 절편은 소수성이므로 파라핀을 제거해야 함. • 자일렌이나 톨루엔이 이용

6. Lab of Developmental Biology 7. 수화(hydration) 8. 염색(staining) 9. 보존(preservation) 광학현미경 표본 제작 • 자일렌을 제거하여 염색 직전까지 가는 단계 • 자일렌을 제거하기 위해서는 다시 알코올이 이용되고 알코올을 제거하기 위해서는 물을 이용 • 조직 속의 여러 가지 물질들의 성질에 따라 서로 다른 색깔이 입혀질 수 있도록 염색을 함. • 가장 일반적으로는 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)을 이용하여 두 번 염색 • 조직은 물 속에 담구어진 상태 • 건조와 부패가 될수 있으므로 이것을 영구히 보존하기 위해서는 mounting sol.을 이용 • 최종적으로 커버글라스를 덮으면 모든 과정은 끝!

7. Lab of Developmental Biology Frozen Section for Stain H&E stain Immunostain Cresyl Violet In Situ

8. Lab of Developmental Biology 염기성 염색약 산성 염색약 조직내 (-)로 하전된 부분 조직내 (+)로 하전된 부분 조직 염색의 원리와 방법 • 색깔을 나타내는 부분이 (-)로 하전 • 조직내 (+)로 하전된 부분과 결합 • 산성 염색약의 예 • 에오신(eosin), 산성 훅신(acid fuchsin), 오렌지 G(orange G) • 색깔을 나타내는 부분이 (+)로 하전 • 조직내 (-)로 하전된 부분과 결합 • 염기성 염색약의 예 • 메틸렌 블루(methylene blue), 톨루이딘 블루(toluidine blue), • 헤마토실린(hymatoxylin) • 핵산(DNA, RNA), 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan) 등 • 염기성 염색약에 염색 • Basophilic • 대부분의 세포질 단백질, 콜라겐(collagen) 등 • 산성 염색약에 염색 • Acidophilic

9. Lab of Developmental Biology Hematein Hematoxylin 껍질(bark) 심재(core) 흰 액재(sap-wood) Hematoxylin • 피나무의 심재에서부터 추출하는 염료는 hematoxylin, hematein 등의 혼합물. • hematein은 hematoxylin의 산화로 만들어짐. • hematein은 색깔을 내기는 하나 잘 달라 붙지 않음. • hematoxylin 염기성 염료로 분류 • 조직에서 인산기가 많이 들어 있는 곳은 세포 핵. (DNA와 RNA는 당과 인산으로 되어 있기 때문) • 조직에서 산성을 띠는 황산기가 많이 들어 있는 곳은 연골 기질(chondroitin sulfate라는glycosaminoglycan) • 세포핵이야 어느 세포에도 있으나 연골 기질은 연골 세포 주위에만 있으므로 hematoxylin 염색이라 함은 핵 염색 을 뜻함. • hematoxylin 염색의 주된 목적은 핵 염색!!

10. Lab of Developmental Biology Hematoxylin의 산화 (산화제 : 공기, sodium iodate, mercuric oxide) Hematein + 매염제(Aluminum) Hematein lake (복합체) pH 2.9에서 (+) Charge (-) Charge의 핵내 인산기와 결합 Bluing (청색화) (Ammonia water, tap water) Principle • Hematoxylin solution 활성성분은 hematein이며, 이것은 Aluminum, Iron 등과 같은 금속이온과 복합체로 존재. • Hematein+Aluminum 복합체를 Hematein lake라하며, 이는 pH 2.9에서 (+)charge • 핵내에 존재하는 인산기는(-)charge를 띄고 있으므로 hematein lake와 결합. • 금속이온으로 aluminum이 사용되었을 경우에는Hematoxylin이 청색으로 염 색되고, Iron이 사용되었을 경우에는 Black 또는 Blueblack으로 염색. • Hematoxylin solution은 그 처방에 따라 색상(hue), 강도(intensity), staining pattern이 다양. Hematoxylin

11. Lab of Developmental Biology Eosin • Eosin은 fluorescein의 유도체. • 새벽 하늘의 장밋빛 • eosin은 산성 염료이기 때문에 염기성을 띠는 원자단과 결합하여 색깔을 냄. • 염기성을 띠는 원자단으로서 세포의 안팎에 널리 분포하고 있는 것은 단백질의 아미노기(NH3+). 그래서 eosin을 이용하여 염색. • 조직 염색에서는 hematoxylin으로 세포핵을 염색한 후 세포질이나 세포 바깥 구조를 대 비시키기 위해 eosin으로 대조 염색. • 핵에도 여러 가지 단백질이 들어 있어 eosin에 붉으스레 염색되나 hematoxylin에 의한 진한 푸른색 때문에 감춰짐. • eosin으로 염색한 결과는 새벽 하늘의 붉은 빛. • 새벽 하늘의 붉은 빛이 매력적이어서인지 eosin을 립스틱이나 매니큐어에 넣기도 함.

12. Lab of Developmental Biology • Hematoxylin • 세포의 핵, 특히 핵 내의 염색질과 핵막에 염색 • 핵의 핵질(nucleoplasm)은 염색 되지 않은 채로 남기 때문에 염색질 의 염색패턴을 쉽게 볼 수 있음. • Eosin • H&E염색에서 Eosin은 대조염색으로 사용 • Hematoxylin에 염색되지 않는 거의 모든 구조에 염색 Hematoxylin & Eosin Stain • 일반적인(Routine) 염색법 • 병리조직표본의 가장 기본적인 염색법 • 표본 전체를 개괄적으로 보기 위한 염색법

13. Lab of Developmental Biology Subject :H&E Stain Object 동결 절편한 난소와 정소의 H&E stain을 통해 stain의 원리와 절편한 조직의 구조를 알아보자.

14. Lab of Developmental Biology OCT compound remove : Xylene 5min Step 1. Hydration 1. 100% EtOH 2min 2. 95% EtOH 2min 3. 85% EtOH 2min 4. 70% EtOH 2min 5. Tap water 5min Step 2. Hematoxylin stain (Nucleus) 1. Harris hematoxylin 5min 2. Tap water 2min Step 3. Hematoxylin differentiator 1. 1% HCl-EtOH 5~10 dip Step 4. Blueing 1. 0.5% Ammonia water 5~10 dip Step 5. Eosin (Cytoplasm) 1. Eosin 3min Step 6. Dehydration 1. 70% EtOH 2min 2. 85% EtOH 2min 3. 95% EtOH 2min 4. 100% EtOH 2min Step 7. Clearing or Dealcoholization 1. Xylene I 3min 2. Xylene II 3min Step 8. Mount & observation Methods

15. Lab of Developmental Biology Ovary x15 CO 피질(cortex)SE 표면상피(superficial epithelium) ME 수질(medulla) OF 난포(ovarian follicle) 원시난포(primordial follicle) x400 FC 난포상피세포(follicular epithelial cell) ZP 투명층(zona pellucida) OC 난모세포(oocyte) TC 난포막(theca cell)

16. Lab of Developmental Biology Ovarian-follicle 후기 이차난포, x15 OC: 난모세포(oocyte) FE: 난포상피(follicular epithelium) TI: 내난포막(theca interna) TC: 내난포막세포(theca interna cell) 일차난포(primary follicle), x100 GC: 과립층세포(granulosa cell) TC: 난포막세포(theca cell) PF: 원시난포(primordial follicle) 후기 이차난포, x40 AN: 난포동(antrum) GC: 과립층세포(granulosa cell) TE: 외난포막(theca externa) ST: 지질(stroma) 초기 이차난포(secondary follicle), x100 OC: 난모세포(oocyte) ZP: 투명층(zona pellucida) AN: 난포동(antrum)

17. Lab of Developmental Biology Testis sd sc sz sg x150 sg 정조세포(spermatogonia)sc 정모세포(spermatocyte) sd 정세포(spermatid) sz 정자(spermatozoa) x40

18. Lab of Developmental Biology Cardiomyocyte Mouse Blood vessel