1 / 97

甘蓝下胚轴培养快繁无菌系

项目四. 甘蓝下胚轴培养快繁无菌系. 教学目标. 教学终极目标. 会用甘蓝下胚轴诱导愈伤组织、愈伤组织诱导分化成小植株。. 促成目标. 会用种子播种获取甘蓝无菌苗； 会无菌操作技术 会用细胞全能性理论解释器官发生. 工作任务. 任务一 对培养室、接种器械及接种人员进行消毒灭菌。 任务二 对外植体进行消毒灭菌 任务三 接种外植体，培养获得无菌苗。 任务四 切取无菌苗下胚轴进行培养。 任务五 对下胚轴培养的无菌苗进行增殖和生根培养。 任务六 对甘蓝无菌苗进行驯化和移栽。. 项目介绍. 快繁珍贵材料 保存雄性不育材料 获得转基因再生植株

paiva
Download Presentation

甘蓝下胚轴培养快繁无菌系

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 项目四 甘蓝下胚轴培养快繁无菌系

  2. 教学目标 教学终极目标 • 会用甘蓝下胚轴诱导愈伤组织、愈伤组织诱导分化成小植株。 促成目标 • 会用种子播种获取甘蓝无菌苗； • 会无菌操作技术 • 会用细胞全能性理论解释器官发生

  3. 工作任务 任务一 对培养室、接种器械及接种人员进行消毒灭菌。 任务二 对外植体进行消毒灭菌 任务三 接种外植体，培养获得无菌苗。 任务四 切取无菌苗下胚轴进行培养。 任务五 对下胚轴培养的无菌苗进行增殖和生根培养。 任务六 对甘蓝无菌苗进行驯化和移栽。

  4. 项目介绍 快繁珍贵材料 保存雄性不育材料 获得转基因再生植株 固定杂种优势

  5. 相关实践知识 任务一 对接种环境、接种器械及接种人员进行消毒灭菌 接种室的灭菌 1.接种室的地面，墙壁要擦洗干净 2.接种前用甲醛10ml/m2，5g高锰酸钾熏蒸 3.接种室还可以采用紫外灯灭菌

  6. 超净工作台灭菌： 1、开风机前将紫外灯打开30min以上 2、之后开风机15min 3、用95%酒精洗工作台面

  7. 接种器皿、用具的灭菌：用具先用95%酒精浸泡后，于酒精灯外焰灼烧或使用消毒器消毒接种器皿、用具的灭菌：用具先用95%酒精浸泡后，于酒精灯外焰灼烧或使用消毒器消毒

  8. 工作人员接种前应做的准备工作 1、个人卫生，穿工作服 2、用70%酒精擦手

  9. 灭菌关键性问题 适当的灭菌剂搭配 适当的灭菌剂浓度 适当的灭菌时间 注意接种操作 防止污染 分布均匀 注意对象

  10. 预处理： 1、组织修整 2、流水冲洗 灭菌 1、灭菌要求：消灭病菌，不损伤组织材料 2、消毒剂： 杀伤力强 特点 易被清除 不损伤植物材料 一、外植体的灭菌 任务二 对外植体进行消毒灭菌 常用灭菌剂：升汞、次氯酸钠 、次氯酸钙 、酒精、双氧水 、硝酸银 、溴水

  11. 灭菌原理 自来水：除去尘土，清洁剂去掉表面垢污。 *汞对环境是有毒的，因此汞溶液使用后收集到一个大的容器中。在溶液中加入氨水，汞可以沉淀，利用虹吸管去除表面沉淀。 酒精：70%酒精使蛋白质失活。95%有时被用来溶解外植体表面的腊质层。 NaClO（商业漂白剂）或Ca(ClO)2：活性在于Cl- 和其他氧化反应。 HgCl2活性在于Cl-和使蛋白质失活的重金属。 润湿剂（例如：Teepol、吐温20）可以加到上述溶液中，提高效果。

  12. HgCl2：Hg2＋+ 蛋白质 细菌蛋白变性 次氯酸钠和次氯酸钙： Cl- +氨基 蛋白质氧化、代谢功能发生障碍。 漂白粉： CaCl2+Ca(ClO)2+H2O 2Cl2 +2Ca(OH)2 Cl2+H2O HCl + HClO 2HClO 2HCl +O2

  13. 典型的灭菌流程 材料的预处理 (剪切、清洗) 75%酒精 (20 s) 0.1%升汞 (15 min) 无菌水冲洗 （6次） 接种 沥干 表面灭菌 通用过程： 1、根据培养容器大小将材料切割成适当大小； 2、流水（自来水）冲洗植物表面：1-2hour； 3、在酒精中晃动几秒钟; 4、HgCL2（0.1～1%）＋Teepol（阴离子去垢剂）2滴/100ml：3～5min 5、用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗 6、商业漂白剂7～15%＋Teepol 2滴/100ml：10～30min 7、再用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗几次

  14. 兰花花枝的无菌消毒

  15. 接种室的灭菌 超净工作台的灭菌 接种前准备 接种器皿、用具的灭菌 工作人员接种前应做的准备工作 材料的灭菌 任务三 外植体的接种和培养 （一）接种 原则：杜绝一切可能的污染

  16. （二）防止污染与接种 防止空气污染 防止操作带来的污染 防止器皿用具污染

  17. 人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。 器皿和用具 培养皿： 洗→热压 玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→ 泡75%~95%酒精→烧 污 染 来 源 培养基：湿热 物品因素 外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理 内部细菌 培养材料 茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平 操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸（甲醛或者甲醛： 高锰酸钾=10:1)

  18. 防止空气污染 接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，然后打开瓶口。为防止灰尘或细菌落入瓶中，瓶子应拿成斜角

  19. 防止操作带来的污染 A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速 正 确 错误

  20. B、接种过程中尽可能达到悬空要求 错误 正 确

  21. C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 正 确 错误

  22. D、瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口 正 确 错误

  23. 防止器皿用具污染 接种完一瓶火烧用具或消毒器灭菌以防止交叉污染产生

  24. 分布均匀 外植体必须与培养基紧密接触，且在培养容器内均匀分布，以保证营养的充分利用，以及光照条件均匀一致 错 误 正 确

  25. 注意对象 根据培养对象采取相应合适的接种方法，具体为： （1）种子和分生组织 （2）接种茎段 （3）接种带腋芽的茎段

  26. （1）种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足。（1）种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足。 正 确 错误

  27. （2）接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中（2）接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中 正 确 错误

  28. （3）接种带腋芽的茎段：为促进带顶芽的离体茎段中腋芽的生长，最好将茎段平放在培养基上，可破除顶端优势，有利腋芽生长。（3）接种带腋芽的茎段：为促进带顶芽的离体茎段中腋芽的生长，最好将茎段平放在培养基上，可破除顶端优势，有利腋芽生长。

  29. 1、光照 2、温度 3、湿度 三 外植体的培养

  30. 事实上要对每种特定的植物甚至每一特定阶段调整最优化的温度。对大多数植物日间培养室的温度调节点在22 ±2℃。 夜间的温度通常要低几度。 由于温室效应容器内的温度要比室温高（可达5℃）。 培养室的一个主要的问题是维持始终如一的温度。是梯度的。 保障措施：需要安装一个很大的自动调温器，当温度太高时可以关掉灯光。 温 度

  31. 通常用荧光灯，在架子上平行安放。大多数情况是装在培养室的外面，以避免热。 以下的光参数是重要的：光周期 和光强 光

  32. 大多数情况光周期不是最重要的。通常是12-16h光照。 为了节省能源和降低安装费培养室内不同架子上的灯不必同时打开。 光周期

  33. 适当的光密度是30µmol.m-2.s-1，这一光强下为混合培养类型。 自养型组培则需要达到250µmol.m-2.s-1。 依据不同类型的容器，容器内的光强或多或少被减弱。 光 强

  34. 光谱是光形态建成的因素（植株高度以及叶片伸展） 重要的比率：蓝光/红光，红光/红外光谱因灯不同而不同 光 谱

  35. 培养室的相对湿度（RH）通常不控制标准容器其顶部空间水蒸气饱和容器内的RH可以通过不同的装置控制通风，底部冷却，琼脂浓度 。 湿 度

  36. 在组培容器中顶部空间的成分组成与温室空气有显著的区别，见下表：其他挥发性气体含量微小。 容器气体组分

  37. 成分 温室环境 容器中的空气 O2 22 % as low as 4 % N2 77 % up to 87 % CO2 365 - 1000 ppm up to 20 % 水蒸气 60-85 % ± 100 % 乙烯 5 ppb - 100 ppb > 2 ppm

  38. 一、外植体的成苗途径 二、污染源 三、愈伤组织培养 拓展知识

  39. 拓展知识一 外植体的成苗途径 根、芽 愈伤组织 芽 根 根 芽 试 管 苗 外植体 胚状体 根、芽

  40. 四种情况 一、不定芽方式（adventitious bud） 不定芽发生一般分3个不同的生长阶段 1、外植体脱分化形成愈伤； 2、愈伤组织中形成一些分生细胞，形成瘤状结构， 这是细胞分化、分化组织出现和有限细胞分裂的共同结果； 3、器官原基形成（发生顺序不一致）

  41. （1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根； （2）先长芽，后长根，多数情况； （3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物； （4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。 小麦的形态发生 试管苗 愈伤组织 芽分化 愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：

  42. 胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。 愈伤组织 脱 分 化 再生植株 外植体 胚状体 由外植体经胚状体形成完整植株的过程： 二、胚状体方式（somatic embryo）

  43. 注意：体细胞胚 1、不同于合子胚 高等植物的卵细胞在受精后发育成 的胚称为合子胚 合子胚 2、不同于孤雌/雄胚 高等植物的性细胞不经受精直接发育成的胚称为孤雌/雄胚 3、不同于器官发生

  44. 胚状体与合子胚的比较:

  45. ①胚状体具有两极性，即有茎端和根端。 ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。 ③胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形。 胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:

  46. 胚状体发生方式的优点： • 胚状体产生的量比不定芽多； • 胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存； • 胚状体的有性后代遗传性 更接近母体植株。 体细胞胚发生与器官发生

  47. 胚状体 制人工种子对胚状体的要求是： • 形态应和天然胚相似，其发育须达子叶形成时期，萌发后能生长成具有完整茎、叶的正常幼苗； • 其基因型应等同于亲本； • 要求人工种皮内应富含营养物质、激素、维生素、菌肥及化学药剂等，供胚状体萌发生长等需要。还要求有一定的硬度耐干燥且能长期保存。

  48. 拓展知识二、污染源 接种后观察 细菌污染 真菌污染 材料内部带菌

More Related