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C 端. N 端. 双缩脲法测定蛋白质的浓度. 相关知识. 目前常用的有四种经典方法： 定氮法：灵敏度 0.2 ~ 1.0 mg 双缩尿法（ Biuret 法）： 1 ~ 2 mg Folin－ 酚试剂法（ Lowry 法）： 50 ~ 100 μg 紫外吸收法： 5 μg 考马斯亮蓝法（ Bradford 法）： 1 ~ 5 μg. 2. 180 0. ＋ NH 3. H－. 加热. 2. 双缩脲. 2. 2. 2. 2. 2. 双缩脲. 双缩脲反应: 碱性环境. H 2 O
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C 端 N 端 双缩脲法测定蛋白质的浓度
相关知识 • 目前常用的有四种经典方法： 定氮法：灵敏度0.2~1.0mg 双缩尿法（Biuret法）：1~2mg Folin－酚试剂法（Lowry法）：50~100μg 紫外吸收法：5μg 考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg
2 1800 ＋ NH3 H－ 加热 2 双缩脲 2 2 2 2 2 • 双缩脲
双缩脲反应:碱性环境 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物
双缩脲试剂 • 蛋白质含有两个以上的肽键（与双缩脲中肽键相似），因此有双缩脲反应。 • 比色分析法 溶液的颜色和光的选择吸取、光的吸收定律：T%与A或E A＝εCL
一、实验目的 • 掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 • 学会使用721或7220型分光光度计并了解仪器的基本结构。
二、实验原理 • 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。 • 在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540－560毫微米下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 • 除－CONH－有此反应外，－CONH2－，－CH2－NH2，－CS－NH2等亦有此反应。
三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器 吸量管（1毫升，2毫升，5毫升）、试管及试管架、721或7220型分光光度计。 （二）材料 1． 标准蛋白溶液(2~5mg/ml)、未知液 （三）试剂 1．双缩脲试剂 溶解0.175克硫酸铜（CuSO4.5H2O）溶于15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h，再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。
四、实验操作步骤 （一） 绘制标准曲线 （二）未知样品蛋白质浓度的测定 1．取12支试管 6支分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准 6支分别加入1毫升不同稀释浓度的待测液（两两相同）。 2.分别加水补足到2毫升。 3.分别加入4毫升双缩脲试剂在室温下放置30分钟。 4.在540毫微米波长下7220型分光光度计比色、读数，记录各管A值。 ．
五、实验结果与讨论 • 前6管每管蛋白的含量为横坐标绘制标准曲线。 • 待测液中选择吸光值在标准曲线范围内的作为计算基础。求出待测液蛋白含量是？单位mg/ml
