金奈米粒子循環增強訊號法

1. 金奈米粒子循環增強訊號法

2. 金奈米微粒的特性 • 金是一種極為安定、具抗氧化功能且是高度的生物相容性材料。 • 奈米金，它的大小遠小於光的波長，由於「表面電漿共振」的效應，某些光波會被奈米金吸收，導致金不再金光閃閃，而是呈現紅寶石色。 （光學特性） http://web1.nsc.gov.tw/ct.aspx?xItem=10205&ctNode=40&mp=1

3. 奈米金的熔點、硬度等性質與黃金都有很大的不同。奈米金的熔點、硬度等性質與黃金都有很大的不同。 • 奈米金具多樣化的表面修飾。 • 舉凡電子、半導體、觸媒、染料、生醫等領域中，都可以發現它的蹤跡。 http://web1.nsc.gov.tw/ct.aspx?xItem=10205&ctNode=40&mp=1

4. 金奈米粒子因表面共振效應，使其在波長520nm 會有吸收峰的變化，顏色變化為紅色而非金黃色。金奈米粒子因其粒徑易控制且具有良好穩定性及生物相容性，被應用在bioassay中。

5. 目前金奈米粒子已廣泛的運用在電子、光學與生物等領域，尤其在生物晶片與表面電漿生物感測器的開發更是頻繁目前金奈米粒子已廣泛的運用在電子、光學與生物等領域，尤其在生物晶片與表面電漿生物感測器的開發更是頻繁

6. 依據其本身特殊的光學性質，以及官能基化後可與生物分子相容之優點依據其本身特殊的光學性質，以及官能基化後可與生物分子相容之優點 • 可以在金奈米粒子的表面修飾特殊的標的核酸或蛋白分子，便可快速及正確地找到錯誤的基因或異常的細胞 (如腫瘤細胞)，達到基因診斷與治療的目的。

7. 充當電子顯微鏡的對比試劑 • 利用金奈米粒子高電子密度的特性，在有膠體金(colloidal gold) 標記之蛋白質，於電子顯微鏡下為黑褐色顆粒，當這些標記物在相對應的配體處大量聚集時，可產生紅色或粉紅色斑點，因而可用於定性或半定量的快速免疫金標記技術 (immunogold labeling technique)，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀 染色 (immunogild silver staining,IGSS)。

8. 免疫金銀染色法的應用大部分是在真核組織(eukaryotic tissues) 與惡性組織 (malignant tissue) 等人類組織上，這些應用已發現具有大幅增加傳統光學，跟電子顯微鏡觀察的解析能力。

9. 增加光學偵側的訊號 • 金奈米粒子的表面電漿帶 (Surface plasmon band)的吸收波峰位於 520 nm，金奈米粒子的表面在檸檬酸鈉的還原下帶正電荷，可以與不同長度的 DNA 或蛋白質鍵結，結合後的金奈米粒子的吸收波峰會有偏移的現象，因此可以放大待測物的訊號。

10. 固定酵素 • 1996 年時，Natan, M. J.等人利用富含有氫氧基(-OH) 的玻璃表面上，與經水解後的 MPS (是一種含有硫基衍生物所形成的分子粘著劑) 中之 Si-OR 基形成矽烷醇 (Silanol, Si-OH) 的共價鍵鍵結後，在藉由氣相沉積 (Vapor-Deposited) 將金與硫基產生自我組裝的作用 (SAM, self-assembled monolayers) 的特性，使得在玻璃表面上可以間接銜接上金奈米粒子，之後再將酵素 (HRP) 固定在金奈米粒子上，而達到固定酵素的目的。

11. 金奈米粒子與 DNA 的結合 • 金奈米粒子與 DNA 的結合策酪主要是由美國西北大學的 Mirkin博士與柏克萊大學的 Alivisatos 博士所帶領的兩大團隊在 1996 年所發表

12. Mirkin 研究小組利用金奈米粒子發展出一種可逆的奈米粒子組裝方法：使用已修飾含硫氫官能基之DNA 序列將各個原本分散的 13 nm 金奈米粒子，經由表面的單股 DNA (single-strand DNA，簡稱 ssDNA) 與互補單股 DNA 雜合 (hybrize) 而形成穩定的金奈米粒子-DNA 接合物。

13. 當金奈米粒子-DNA結合物與外加的 DNA 互補之後，金奈米粒子就會因為DNA 之間的鹼基配對而相互聚集，其表面電漿帶也會出現紅偏移的現象，所以其顏色就會從紅色轉變藍色。藉由 DNA 互補配對的特性已應用於現在許多基因的檢測方法上。

14. 金奈米粒子與蛋白質的結合 • 透過金奈米粒子與與硫氫基或胺基的鍵結，金奈米粒子很容易與蛋白質，包括抗體、酵素或胜肽，甚至是與病毒相結合。

15. 因此，金奈米粒子結合蛋白質的研究也是為大家所感興趣的。金奈米粒子結合蛋白質最早的應用就是結合抗體來作為電子顯微鏡上標的位置的觀測。隨著奈米科技的進步，科學家對於金奈米粒子結合蛋白質的研究與應用也越來越多。因此，金奈米粒子結合蛋白質的研究也是為大家所感興趣的。金奈米粒子結合蛋白質最早的應用就是結合抗體來作為電子顯微鏡上標的位置的觀測。隨著奈米科技的進步，科學家對於金奈米粒子結合蛋白質的研究與應用也越來越多。

16. 生物醫學領域上的應用 • 醫學檢測、疾病診斷、基因偵測 因為金有良好的生物相容性，而且奈米化的 金表面具有特殊效應，容易與硫氫基結合。 美國西北大學莫京（Mirkin）博士在1996 年 發現，奈米金可與DNA 輕易結合，利用這個現象 ，便可用奈米金製作能檢測許多遺傳疾病的DNA 晶片。 http://web1.nsc.gov.tw/ct.aspx?xItem=10205&ctNode=40&mp=1

17. 奈米金也容易與蛋白質結合，如抗體、酵素或細胞激素，最普遍的例子就是在驗孕棒上的應用。奈米金也容易與蛋白質結合，如抗體、酵素或細胞激素，最普遍的例子就是在驗孕棒上的應用。 此外，也有科學家利用奈米金結合特殊的抗體，用來做為標的癌細胞的工具。 http://web1.nsc.gov.tw/ct.aspx?xItem=10205&ctNode=40&mp=1

18. 生物醫學領域上的應用

19. 金奈米粒子在檢測及生醫的應用 Surface modified with target ssDNA  ssDNA Hg2+ Aptamer Antibody antigen hapten Peptide cell Gold-shell nanoparticles Core (Fe, Si, or Co…)

20. 金奈米粒子在檢測及生醫的應用 Lateral flow test The Lycurgus Cup dates from Roman times.

21. ssDNA-Au nanoparticles 1. Thaxton, C.S., Georganopoulou, D.G., Mirkin, C.A. 2006 Clin. Chim. Acta, 363, 120-126. 2. Sato, K., Hosokawa, K., Maeda, M. 2003 JACS, 125 , 8102-8103.

22. ssDNA-Au nanoparticles 1. Thaxton, C.S., Georganopoulou, D.G., Mirkin, C.A. 2006 Clin. Chim. Acta, 363, 120-126. 2. Sato, K., Hosokawa, K., Maeda, M. 2003 JACS, 125 , 8102-8103.

23. (b) (a) DNA結合金奈米粒子之分析 穿遂式電子顯微鏡(TEM)之分析 以TEM觀測DNA-金奈米粒子分佈情形 (a) DNA(SH 1,SH2)/金奈米 粒子 (b)加入Linker

24. Single-Nucleotide Polymorphism Jishan Li, Xia Chu, Yali Liu, Jian-Hui Jiang, Zhimin He, Zhiwei Zhang, Guoli Shen and Ru-Qin Yu Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 19 e168

25. Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S.-Y., Analytical Biochemistry2008, 375, 299-305

26. Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S.-Y., Analytical Biochemistry 2008, 375, 299-305

27. Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S.-Y., Analytical Biochemistry 2008, 375, 299-305

28. Mercury detection Yang-Wei Lin, Chih-Ching Huang and Huan-Tsung Chang Gold nanoparticle probes for the detection of mercury, lead and copper ions Analyst, 2011, 136, 863

29. Antibody- gold nanoparticles Colony Printing S.B.Fang, W.Y. Tseng, H.C. Lee, C.K. Tsai, J.T. Huang, S.Y. Hou, J. Microbio. Methods 77 (2009) 225–228

30. Hapten detection w/ Silver Enhancement Hou, S. Y., Chen, H.K., Cheng, H.C., Huang, C.Y., Analytical Chemistry (2007) 79: 980-985.

31. 免疫層析法 免疫層析法又稱做層流法，原是以抗原為分析物，利用抗體偵測之。近年來也應用於DNA 檢測，由於核酸的檢測，不一定使用抗體，故稱為層流法會比免疫層析法更貼切。

32. 免疫層析法 此一方法的特徵在於操作方便，成本低廉，很適合用於大量篩選或者是非檢驗室人員來執行的重點照護檢驗 (point-of-care testing)，這類檢驗並不是在醫院檢驗室中執行，而是在病患的身旁作檢驗，諸如醫師診療室，病房，甚至於在病患家中做檢驗。

33. 免疫層析法 以層流法為原理的生物感測器，其組成大致可分為四個部分：sample pad，conjugate pad，nitrocellulosemembrane 以及absorbent pad 。

34. 層流法生物感測器原理示意圖 奈米金粒子為酒紅色

35. 免疫層析法 將含有分析物之溶液置於sample pad，由於absorbent pad 的吸水能力及毛細管原理，溶液沿著nitrocellulose membrane 移動至conjugate pad，其內含有奈米金等有色粒子，這些有色粒子上有抗體或其它可於分析物專一結合的化學分子。

36. 溶液中的分析物與有色粒子結合，繼續往absorbent pad 移動，至test line，其含有另一可與分析物專一結合的化學物質。如果溶液中有分析物存在，則有色粒子在此呈色。而control line 上的化學物質可結合有色粒子上的化學物質，所以只要有色粒子上仍有該化學物質，control line 將呈色。反之control line上未呈色，該biosensor 則判定為失效。

37. 在層流法中的colored particles 中，最常見的為金奈米粒子。Ngom 等人所做的文獻調查顯示，在72篇已發表的層流法報告中，1.4% 使用latex 為其colored particles，磁珠也佔1.4%，而使用金奈米粒子則佔75% 。

38. 金奈米粒子又稱為膠體金 (colloidal gold)、金溶膠 (goldsol)，因表面電槳共振 (surface plasmaabsorption) 效應，造成在波長520 nm 形成吸收峰，而使得其顏色為紅色而不再是金黃色。

39. 其粒徑容易控制且具良好穩定性及生物相容性，故常用於檢測蛋白質、DNA 等生物物質。金奈米粒子也被用在細胞生物性樣品的電子顯微鏡研究裡作為追蹤標籤。還可以利用銀還原反應，使銀還原於金奈米粒子的表面，藉此加強訊號。

40. 金奈米粒子標籤原本在電子顯微層級上可被觀察到，銀還原反應後產生更高對比的訊號，此標籤利用光學顯微鏡即可被觀察到。近年來，在免疫層析技術中銀增強試劑也常被用來放大金奈米粒子的訊號，它能增加靈敏度約1,000 倍。

41. Ab-AuNP Lateral Flow StripBiosensors 抗體為脊椎動物所產生的蛋白質，在生物分析上最常用的抗體為免疫球蛋白G ，其為人體五種不同的免疫球蛋白 (IgG、IgA、IgM、IgD、IgE) 中含量最高的抗體。IgG 是由四個peptide (兩條完全相同的輕鏈與兩條完全相同的重鏈) 組成，不同鏈間以雙硫鍵鍵結而成，外型近似於英文字母Y。

42. 在Y 的上方兩端為可變區，可各專一地連結同一種抗原，例如可連結絨毛激素 (β-hCG) 的抗體稱之為anti β-hCG antibody。 Y 的底部為不變區，對於同種的動物其不變區相同，不同種的動物其不變區是不一樣的。值得注意的是，IgG的不變區可為不同種動物的抗原。舉例而言，老鼠IgG的不變區打入兔子、山羊等動物的血管中，可產生抗體專一地連結之，此抗體即為anti-mouse IgG antibody。

43. Lateral flow biosensor DNA-AuNP lateral flow strip biosensors 驗孕試紙之原理 (免疫層析法)

44. 層流法生物感測器中最為廣泛地使用應為驗孕試紙，本篇報導即以此為例簡略說明Ab-AuNP lateral flowstrip biosensors的原理。由於懷孕婦女會分泌出一種特定的荷爾蒙稱之為絨毛激素 (β-hCG)，故可以此荷爾蒙之有無推定婦女是否懷孕。

45. 將anti β-hCGantibody 固定於金奈米粒子上，將另一anti β-hCGantibody 固定於test line 上，此兩抗體連接於絨毛激素不同的位置，即不同的表位 (epitope)。如果尿液中有絨毛激素存在，則奈米金停留在test line 上，故呈紅色。而control line 上的抗體可連結金奈米粒子上的anti β-hCG antibody 的不變區。

46. 舉例而言，如果anti β-hCGantibody 是來自老鼠，則control line 上固定了anti-mouseIgG antibody。所以只要金奈米粒子上anti β-hCGantibody 仍存在，control line 將呈色。反之control line上未呈色，該biosensor 則判定為失效。

47. Ab-AuNP lateral flow strip biosensors 應用於很多生物檢測中，以下是一些案例。

48. 鑑於全世界食品安全與公共衛生需求，食源性致病菌之快速檢測系統平台為當前蓬勃發展之研究課題，此類食源性致病菌之快速層流檢測是仿照ELISA抗體-抗原-抗體之三明治型態，將原本構築抗體之固態孔盤槽壁，以硝化纖維膜取代，將抗體固定於其上，再利用另一結合金奈米粒子之特異性抗體捕捉檢測抗原呈色，原理同上述驗孕試紙。其中腸致病性之病原菌檢測法發展諸多，均屬此類Ab-AuNP lateral flow stripbiosensors 之代表。

49. Ab-AuNP lateral flow strip biosensors 的原理

50. 茲例舉大腸桿菌與沙門氏菌之研究發展如下： 日本的Nakasone 等人於2007 年發表一種藉由測定分泌之EspB蛋白來辨識腸致病性 (enteropathogenic E.coli, EPEC) 或腸出血性大腸桿菌 (enterohemorrhagic E.coli, EHEC) 之快速層流檢測法4。EspB 為第三型蛋白分泌系統所分泌，存在菌體培養液及受感染細胞的胞膜及胞質中，其與細胞訊息傳導和細胞肌動蛋白重組有關，是EHEC O157:H7 之致病關鍵因子。