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华中农业大学. 2010-8-13 苏州. 牛传染性鼻气管炎 基因缺失 疫苗研究. 刘正飞 lzf6789@mail.hzau.edu.cn 15827105775. 报告 提纲. 背景 技术路线 结果与分析 结论. 研究背景. 牛传染性鼻气管炎 （ IBR ） 又称 “ 坏死性鼻炎 ” ，是由 牛疱疹病毒 1 型 （ BHV-1 ） 引起的牛的呼吸道感染和繁殖障碍传染病。 主要表现为传染性鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产等， 被 OIE 列为 B 类疫病。
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华中农业大学 2010-8-13 苏州 牛传染性鼻气管炎基因缺失疫苗研究 刘正飞lzf6789@mail.hzau.edu.cn 15827105775
报告提纲 • 背景 • 技术路线 • 结果与分析 • 结论
研究背景 • 牛传染性鼻气管炎（IBR）又称“坏死性鼻炎”，是由牛疱疹病毒1型（BHV-1）引起的牛的呼吸道感染和繁殖障碍传染病。主要表现为传染性鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产等，被OIE列为B类疫病。 • BHV-1是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的成员。同其他疱疹病毒导致的疾病一样，该病极难根治，原因在于：病毒在侵入牛体后，能在神经细胞上形成潜伏性感染，机体无法彻底清除（Coendm, 1989）。病牛长期乃至终生带毒，在机体抵抗力下降时，又向外排毒。
BHV-1特性：嗜神经性和潜伏感染性 （Lee BJ et al, 1999）
流行病学 • 该病自1955年在美国科罗拉多州发现以来，流传 广泛。除南极洲外，各地都有本病的发生。 有报告显示，以牛传染性鼻气管炎为主的呼吸道综合征对美国养牛业的经济损失每年达30亿美元（Jones et al，2007）！ • 意大利30.4%的成年牛呈阳性反应。 • 英国的较低，为2%。 • 澳大利亚阳性率平均为30%左右。 • 新西兰牛血清抗体阳性率高达31%-81.2%。 • 非洲的乍得和尼日利亚分别为30%和60%。
在我国，70年代首次发现本病，由周泰冲等最早于1981年分离到病毒。1986年邓沛霖、1987年王则兴等从乳牛、水牛、黄牛中分离到病毒，证实在我国牛群中也存在IBR感染 。 • 杨春明（2003）对青海省刚察地区的检测阳性率为30.61 %。 • 王海燕（2006）对我国部分地区阳性检出率为67.10%。 • 颜邦芬（2007）对我国29个省市的1344份奶牛血清的平均阳性检出率为35.8%。 • 王永艳（2010）对山西省雁门关地区665份荷斯坦牛血清进行检测，阳性血清330份，可疑血清55份，病例多发生在卫生差、引种未检疫的养殖场中。
本病的死亡率不高，死亡者大多是由于继发细菌性支气管肺炎所致，澳大利亚奶牛场的牛的发病率和死亡率大约分别为8%和3%。本病的死亡率不高，死亡者大多是由于继发细菌性支气管肺炎所致，澳大利亚奶牛场的牛的发病率和死亡率大约分别为8%和3%。 • 而育肥牛的发病率通常为20-30%，少数高达100%。 • 另外，潜伏的带毒公牛在交配时可恢复感染性，因而在菜牛群中公牛的发病率高于母牛。
目的与意义 • 牛传染性鼻气管炎是牛的一种重要传染病。国外主要通过疫苗免疫，配合诊断试剂盒的检出与捕杀，对该病进行防控。在我国，它也是进出口检验检疫的必检项目。 • 随着我国加入WTO和OIE，进出口贸易的日益频繁以及近年养牛业的快速发展，该病的潜在危害越来越大，但在我国现阶段缺乏商品化的基因工程疫苗。鉴于此，我们开展了基因缺失疫苗的研究，为我国对该病的防控乃至将来的根除计划提供工具。
TK：α疱疹病毒的主要毒力基因。TK缺失的毒株，一方面毒力大幅下降，另一方面使进入神经潜伏状态的病毒很难被再次激活，毒力无法恢复，因此TK基因经常作为研究基因缺失疫苗的候选基因（Kit, 1985）。 • gE：常与糖蛋白gI以形成复合体的形式存在，同时它也是中和抗体的主要靶位点之一，并且对于病毒的复制是非必需的，因此gE可以作为牛传染性鼻气管炎鉴别诊断的一种可靠的标记（Hutchings,1990）。在病毒嗜神经性方面也起着重要的作用，导致gE缺失的病毒不能产生顺行转移，神经毒性大大降低。
结 果 • 带有荧光标签的TK-质粒，以及BHV-1 TK-/EGFP+重组病毒的构建与鉴定。 • 敲除了荧光标签的BHV-1 TK-重组病毒的构建。 • BHV-1 TK-/gE-双缺失重组病毒的构建。 • BHV-1 TK-/gE-的安全性和保护力研究。
C 获得的重组病毒荧光照片 病毒的同源重组和筛选 • 转移质粒与BHV-1基因组用磷酸钙法共转染MDBK细胞，6代纯化后筛选得到TK-/EGFP+重组病毒。 共转染照片 纯化后照片
二.敲除了荧光标签的BHV-1TK-重组病毒的构建与鉴定二.敲除了荧光标签的BHV-1TK-重组病毒的构建与鉴定 • 将pSK TK-和BHV-1 TK-/EGFP+病毒基因组一起用磷酸钙法共转染，5轮纯化得到BHV-1TK-重组病毒。 第一轮纯化照片
C 重组病毒 荧光照片 病毒的同源重组和筛选 • 转移质粒与BHV-1TK-基因组共转染MDBK细胞，7代纯化后筛选得到TK-/EGFP+重组病毒。 共转染照片 纯化后照片
四. BHV-1 TK-/gE-双缺失重组病毒的 安全性和保护力研究
再激活后体温变化 Body temperature of calf after reactivation • 从接种组分组中各选一头健康公牛做再激活试验。从28d开始连续3天，通过肌肉注射0.15 mg/kg体重的地塞米松，以激活处于潜伏状态的病毒。
攻毒组中，出现了明显的鼻黏液，还有继发感染结膜炎产生的颗粒状眼屎，部分牛只甚至出现了咳嗽、呼吸苦难。而免疫组基本正常。表明：攻毒组中，出现了明显的鼻黏液，还有继发感染结膜炎产生的颗粒状眼屎，部分牛只甚至出现了咳嗽、呼吸苦难。而免疫组基本正常。表明： 缺失突变株的接种对试验牛提供了很强的保护力。
讨论 • 在本课题中，利用基因工程方法，成功获得了3株牛传染性鼻气管炎的基因缺失重组病毒。 • 在病毒的构建过程中，我们将得到的TK-重组病毒和亲本毒株同时接种MDBK细胞，观察细胞的病变和蚀斑的形态。结果显示BHV-1 TK-致细胞病变的时间较慢，并且在细胞上形成的蚀斑较小。在进一步gE缺失后，其蚀斑大小更是大大减小，这与Liu（2008）等国际上的诸多报道一致。这也间接证实了BHV-1 TK-/gE-基因缺失后使重组病毒的毒力降低，体外试验的结果在动物试验中也得到了印证。
在动物试验中，重组病毒接种后，我们测量了病毒的排毒量，得到的7 log10 TCID50/mL 的结果与国外学者Kaashoek（1998）对gE缺失突变株的研究结果一致 。但是在持续时间上，我们仅能在5天以内检测到病毒的排出。相比其10天和Liu（2008）8天检出期，时间大大缩短。究其原因，上述学者均是对gE单缺失病毒作出的研究，而我们的重组病毒为缺失了TK基因和gE基因的双缺失病毒 ，因而毒力更弱，排毒能力更差。这也反应了我们的双缺失重组病毒更加安全、可靠。 • 在再激活试验中，地塞米松的剂量一般是0.1mg/kg，而我们使用了1.5倍的常规激活用量，结果显示：即使接种量最大的107组，重组病毒依然没有被激活，表明我们的重组病毒具有十分强的稳定性。
血清学检测上，BHV-1 gE 单缺失病毒产生的中和抗体很低，但是在强毒攻毒后，中和抗体水平可以升高至4倍甚至更高（ Kaashoek，1998）。Liu等（2008）对BHV-1 gE胞浆区缺失后，中和抗体水平也不高。而Wang（2006）甚至得到需用gE免疫4次后才能产生足够的中和抗体的结果。我们的双缺失病毒在免疫一次后，血清中和抗体水平也很低，与上述结果相似。
我们获得的BHV-1 TK-/gE-重组病毒主要具有以下几方面的应用前景： • 1.可以作为牛传染性鼻气管炎病毒预防和控制的候选疫苗。 • 2.可以配合gE-ELSA诊断方法，将疫苗免疫牛和野毒感染牛加以区别开来，为在我国开展牛传染性鼻气管炎计划提供技术支撑。 • 3.将其作为外源基因的表达载体。
结论 • 1.获得了BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。 • 2.动物实验表明BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株对牛具有很高的安全性和很强的保护力。
