ЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОНВЕРСИИ БИОМАССЫ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ

1. ЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОНВЕРСИИ БИОМАССЫ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ Аркадий П.Синицын Химический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН

2. Виды возобновляемого сырья • Сахароза, меласса (из сахарного тростника и сахарной свеклы) • Отходы пищевой промышленности (переработки яблок, цитрусовых, сои, молока, и т.д.) • Крахмалосодержащее сырье (зерно, картофель) • Топинамбур (полифруктан) • Растительная биомасса • Древесина и отходы ее переработки • Однолетние растения, солома, трава, водоросли, и т.п. • Целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства

3. Получение спиртов из отходов пищевой промышленности Отходы переработки сои (галактоолиго сахариды) Сбраживае- мые сахара Ферментация α-Галактозидаза Глюкоза, галактоза Отходы переработки молока (лактоза) Дистилляция, дегидратация β-Галактозидаза Меласса из сахарной свеклы и тростника (сахароза) Этанол, бутанол Ферментация

4. Получение спиртов из отходов пищевой промышленности Отходы переработки яблок ПЕК, ГМЦ, ЦЕЛ Сбражива- емые сахара Ферментация Целлюлазы, пектиназы, гемицеллюлазы Дистилляция, дегидратация Отходы переработки цитрусовых ЦЕЛ, ПЕК Сбражива- емые сахара Целлюлазы, пектиназы Этанол, бутанол

5. Получение спиртов из топинамбура Топинамбур Полифруктан ПЕК Фруктоза Ферментация Эндо-инулиназа, Экзо-инулиназа, Пектиназы Дистилляция, дегидратация Этанол, бутанол

6. Получение спиртов из крахмалистого сырья Этанол, бутанол Утилизация отходов Зерно, в т.числе низкосортное, картофель Глюкоамилаза Дистилляция, дегидратация Ферментация Разжижение, декстринизация Осахаривание Глюкоза Термостабильная α-амилаза

7. Получение спиртов из целлюлозосодержащего сырья (раздельные гидролиз и сбраживание) Утилизация лигнина Этанол, бутанол Целлюлазы, Гемицеллюлазы Сбор и транспортировка ЦСМ Дистилляция, дегидратация Предобработка ЦСМ Ферментативный гидролиз (осахаривание) Сахара (глюкоза, ксилоза) Ферментация

8. Получение спиртов из целлюлозосодержащего сырья (одновременный гидролиз и сбраживание) Утилизация лигнина Этанол, бутанол Целлюлазы, Гемицеллюлазы Сбор и транспортировка ЦСС Дегидратация. дистилляция Предобработка ЦСС Ферментативный Сахара Ферментация гидролиз (осахаривание) Одновременный гидролиз и ферментация

9. Выбор ферментов для гидролиза растительного сырья Солома Зерновая шелуха Кукурузные стебли Древесина Стебли Тростника (багасса) Сельскохоз. отходы Спиртовая барда Предобработка Выбор ферментов для гидролиза β-G Дополнит. ферменты EG CBH Ксиланазы Высокий выход сбраживаемых сахаров (C5 и C6)

10. After Teeri 1997 ЦЕЛЛЮЛОЗА Частично деградиро- ванная ЦЕЛЛЮЛОЗА ЦЕЛЛОБИОЗА ГЛЮКОЗА Эндоглюканазы (EG) Целлобиогидролазы (CBH) ß-Глюкозидазы (ß-G) Ферментативный гидролиз целлюлозы

11. Сравнение эффективности различных методов предобработки лигноцеллюлозного сырья 10 FPU / 1 г субстрата + 20 bGU / г, [S] = 100 г/л, pH 5, 50ºC, 24 h • Багасса / паровой взрыв • Пшеничная солома / паровой взрыв • Овсяная шелуха / паровой взрыв • Рисовая шелуха / паровой взрыв • Хвойная древесина / сухое измельчение • Лиственная древесина / паровой взрыв • Лиственная древесина / органозольв • Целлюлоза (ЦБК)

12. ПРЕДОБРАБОТКА • Предобработка лигноцеллюлозного сырья играет важную роль для увеличения его реакционной способности • Метод сухого измельчения существенно увеличивает реакционную способность лигноцеллюлозного сырья

13. Наличие ферментов, штаммов-продуцентов, систем экспрессии генов (грибы) Штаммы супер-продуценты ферментов: • Различные штаммы Trichoderma sp. • Различные штаммы Penicillium sp. • Различные штаммы Aspergillus sp. Ферменты: • Целлюлазы (CBH1, CBH2, Eg1, Eg2, Eg3, и др.) • β-глюкозидазы (целлобиазы, экзо-β1,4/1,3-глюкозидаза) • Гемицеллюлазы (эндо-ксиланазы, эндо-маннанзы, β-ксилозидазы, арабиназы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, и др.) • Пектиназы (пектин-лиазы, полигалактуроназы) • Амилазы (α-амилаза, глюкоамилаза, и др.) • Инулиназы (эндо-инулиназа, экзо-инулиназа) Системы экспрессии генов: • Penicillium 537 • Penicillium PCA • Aspergillus sp.

14. (I) Стратегия создания штаммов-продуцентов • Селекция продуцента уникальных ферментов среди диких штаммов микроорганизмов, получение супер-продуцента с помощью мутагенеза и селекции, оптимизация процесса ферментации • Проблемы – большие затраты времени, невозможность предсказать состав комплекса секретируемых ферментов

15. Выбор продуцента уникального целлюлазного комплекса. Гидролиз пихты, обработанной паровым взрывом разными целлюлазами10 FPU / 1 г субстрата, [S] = 5%, рН 5, 50оС Penicillium Пихта Trichoderma

16. Созданы промышленные штаммы -суперпродуценты целлюлаз и сопутствующих ферментов • Целлюлазы Penicilliumобладают уникально высокой осахаривающей способностью по сравнению с Trichoderma • Существенно, что именно на целлюлазы Trichoderma делают ставку ведущие мировые биотехнологические компании

17. Целлюлазы Penicillium иTrichoderma • Ферменты Penicillium обладают более высокой осахаривающей активностью, ферменты Trichoderma • Возможные причины: • Более высокая удельная активность индивидуальных ферментов • Большая разнообразность целлюлазного комплекса • Наличие β-глюкозидазы (целлобиазы) • Меньшая степень ингибирования лигнином

18. Генно-инженерный подход

19. Методы получения рекомбинантных штаммов • Получение штамма реципиента (ауксотрофный мутант, маркерный ген) • Выделение целевого гена (гомологичного, гетерологичного) • Включение целевого гена в экспрессионную кассету (создание вектора) • (Ко)трансформация протопластов реципиентного штамма • Регенерация протопластов, первичный скрининг трансформантов на целевую активность (качалочные колбы, планшеты) • Вторичный скрининг трансформантов (1-л, 3-л ферментеры), получение, испытания и изучение свойств ферментных препаратов, выделение и изучение свойств гомогенных целевых ферментов • Получение штамма продуцента

20. (II) Стратегия создания штаммов продуцентов • Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов индивидуальных (целевых) моно-ферментных препаратов • Проблема – моно-ферментные препараты не могут осуществить эффективное осахаривание различных видов растительного сырья

21. Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов индивидуальных (целевых)ферментов (II) Экспрессия β-глюкозидазы в Penicillium 537 (CBH1 промотор) Экспрессия эндо-β1,4-глюканазы В Penicillium 537 (CBH1 промотор) β-G Eg

22. Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов индивидуальных (целевых) моно-ферментных препаратов (II) Экспрессия эндо-β1,4-ксиланазы в Penicillium 537 (CBH1 промотор) Экспрессияэндо-β1,4-маннанзы в Penicillium 537 (CBH1 промотор) Man Xyl

23. Раздельная ферментация рекомбинантных штаммов Penicillium 537 – продуцентов разных целевых ферментов (II) Ферментный препарат Рек.537-Cell Рек. штамм 537-Cell Ферментация Рек.537-Cell Рек. штамм 537-Xyl Ферментный препарат Рек.537-Xyl Мультиферментный препарат Cell + Xyl + bGl Ферментация Рек.537-Xyl Рек. Штамм 537-bGl Ферментация Рек.537-bGL Ферментный препарат Рек.537-bGl Ферментный комплекс для осахаривания определенных видов лигноцеллюлозного сырья

24. Одновременная ферментация различных рекомбинантных штаммов Penicillium 537 – продуцентов индивидуальных ферментов (II) Рек. штамм 537-Cell Мультиферментный препарат Cell + Xyl + bGl Рек. штамм 537-Xyl Одновременная ферментация 537-Cell + 537-Xyl + 537-bGl Рек. штамм 537-bGl Ферментный комплекс для осахаривания определенных видов лигноцеллюлозного сырья

25. (III) Стратегия создания штаммов – продуцентов • Создание штаммов – продуцентов мультиферментного комплекса с увеличенной активностью определенного (целевого) фермента • Проблема – продуктивность по собственным ферментам мультиферментного комплекса может уменьшиться

26. Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов мультиферментного комплекса с увеличенной активностью определенного (целевого) фермента (III) Осахаривание МКЦ Дозировка по белку – 5 мг/г [МКЦ]- 5%, рН 5.0, 50ºC Экспрессияβ-глюкозидазы в Penicillium 537 (Hist промотор) 1 час, Глюкоза и ВС β-G 24 часа, Глюкоза И ВС

27. (IV) Стратегия создания штаммов - продуцентов • Создание штаммов – продуцентов смеси заранее выбранных (целевых) ферментов • Проблема – необходимость иметь в наличии широкий круг очищенных ферментов для предварительных экспериментов по выбору наиболее активных осахаривающих ферментов • Могут возникнуть проблемы при экспрессии смеси целевых ферментов в нужной пропорции

28. Эксперименты по выбору наиболее активных осахаривающих ферментов (IV) Предобработанные кукурузные початки, pH5, 50ºС, 72 часаДозировка по белку – 0.2 мг/мл, целлобиаза – 0.1 ед/мл Контроль: Spezyme CP, Multifect XL, CP + XL Trichoderma индивидуальные ферменты Penicillium индивидуальные ферментыe

29. Создание рекомбинантных штаммов - продуцентов смеси заранее выбранных (целевых) ферментов (IV) Экспрессия целлобиогидролазы и β-глюкозидазы в Penicillium 537 (CBH1 промотор) β-G CBH-s

30. Концепция биофабрики (Корп.Биотехнологии) The Chemical Journal, Дек.2008, с.39

31. Авторский коллектив: Синицына О.А.,Рожкова А.М.,Зоров И.Н., Правильников А.Г., Середа А.С., Волков П.В., Бушина Е.В.,Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д., Федорова Е.А.,Кошелев А.В., Беккаревич А.О., Бубнова Т.В., Окунев О.Н.,Чулкин А.М., Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, Москва Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН, Москва Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино Московской обл.

32. Спасибо за внимание! +7 (495) 939-5966 apsinitsyn@gmail.com www.enzyme.chem.msu.ru/cellulas/