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GIEMSA I CROMOSOMI POSSONO ESSERE ORDINATI PER DIMENSIONE, POSIZIONE DEL CENTROMERO, PRESENZA DI MARCATORI MORFOLOGICI

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GIEMSA I CROMOSOMI POSSONO ESSERE ORDINATI PER DIMENSIONE, POSIZIONE DEL CENTROMERO, PRESENZA DI MARCATORI MORFOLOGICI - PowerPoint PPT Presentation


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COLORAZIONE STANDARD. GIEMSA I CROMOSOMI POSSONO ESSERE ORDINATI PER DIMENSIONE, POSIZIONE DEL CENTROMERO, PRESENZA DI MARCATORI MORFOLOGICI. NOMENCLATURA DEI BANDEGGI. CODICE A TRE LETTERE PRIMA LETTERA PATERN DI BANDEGGIO SECONDA LETTERA AGENTE BANDEGGIANTE TERZA LETTERA

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slide1

COLORAZIONE STANDARD

  • GIEMSA
    • I CROMOSOMI POSSONO ESSERE ORDINATI PER DIMENSIONE, POSIZIONE DEL CENTROMERO, PRESENZA DI MARCATORI MORFOLOGICI
nomenclatura dei bandeggi
NOMENCLATURA DEI BANDEGGI
  • CODICE A TRE LETTERE
    • PRIMA LETTERA
      • PATERN DI BANDEGGIO
    • SECONDA LETTERA
      • AGENTE BANDEGGIANTE
    • TERZA LETTERA
      • SOSTANZA COLORANTE

ESEMPI:

QFQ = QFluorochrome Quinacrine

GTG = GTripsin Giemsa

GHG = GHeat Giemsa

RBG = RBrdU Giemsa

RHG = RHeat Giemsa

RBA = RBrdU Acridine

CBG = CBarium Giemsa

bandeggi morfologici
BANDEGGI MORFOLOGICI
  • BANDEGGGIO Q (QFQ) (CASPERSSON, 1970)
    • SI OTTIENE CON MOSTARDA DI QUINACRINA, FLUOROCROMO AFFINE ALLE BASI A-T
    • CARIOTIPI DI ROUTINE
    • STUDIO DELLA REGIONE ETEROCROMATICA DEL CROMOSOMA Y
    • STUDIO DI VARIANTI POLIMORFICHE
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BANDEGGIO G (GTG, GHG)
    • SI OTTIENE MEDIANTE DIGESTIONE ENZIMATICA (TRIPSINA) O DEGRADAZIONE TERMICA (40-50°C) DELLA CROMATINA
    • PATTERN SOVRAPPONIBILE AL BANDEGGIO Q
    • MAGGIORE DEFINIZIONE
    • CARIOTIPI DI ROUTINE
    • BANDEGGI AD ALTA RISOLUZIONE
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BANDEGGIO R (Reverse) (RHG, RFG)
    • SI OTTIENE MEDIANTE DEGRADAZIONE TERMICA (87°C) DELLA CROMATINA O CON FLUOROCROMI AFFINI ALLE BASI G-C (ARANCIO DI ACRIDINA, HOECHST 33258)
    • PATTERN OPPOSTO AI BANDEGGI Q/G
    • CARIOTIPI DI ROUTINE
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BANDEGGIO C (CBG)
    • SI OTTIENE MEDIANTE DENATURAZIONE DEL DNA CON BASI FORTI (BaOH) ED ALTE TEMPERATURE. SI COLORANO SOLO LE REGIONI DI ETEROCROMATINA COSTITUTIVA (CENTROMERI, COSTRIZIONI SECONDARIE, ETEROCROMATINA DELL'Y), RESTA L'OMBRA DEL CORPO DEL CROMOSOMA
    • RICERCA DI POLIMORFISMI CROMOSOMICI
    • STUDIO DELLA REGIONE ETEROCROMATICA DEL CROMOSOMA Y
    • CARATTERIZZAZIONE DI CELLULE TUMORALI
    • IDENTIFICAZIONE DI REGIONI AMPLIFICATE
bandeggi dinamici o bandeggi replicativi
BANDEGGI DINAMICIOBANDEGGI REPLICATIVI

SI OTTENGONO MEDIANTE INCORPORAZIONE IN COLTURA DI 5-Bromo 2-desossi-Uridina (BrdU) DURANTE FRAZIONI

DELLA FASE S

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LE REGIONI CHE HANNO INCORPORATO BrdU SONO VISUALIZZABILI CON PARTICOLARI COLORAZIONI
    • BrdU SPEGNE LA FLUORESCNZA DI DIVERSI FLUOROCROMI: ARANCIO DI ACRIDINA, HOECHST 33258
    • BrdU INDUCE FOTOLISI PREFERENZIALE DOPO COLORAZIONE CON FLUOROCROMI ED ESPOSIZIONE A LUCE UV (COLORAZIONE FPG)
    • LE ZONE CHE HANNO INCORPORATO BrdU APPAIONO POCO FLUORESCENTI O PALLIDE
  • I BANDEGGI DINAMICI PERMETTONO DI COSTRUIRE MAPPE REPLICATIVE DEI CROMOSOMI
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MODULANDO I TEMPI DI TRATTAMENTO CON BrdU SI OTTENGONO BANDEGGI CON PATTERN SOVRAPPONIBILE A QUELLO DEI BANDEGGI MORFOLOGICI

FASE S INIZIALE BANDE G

FASE S TERMINALE BANDE R

FASE S FINALE BANDE T

N.B.B.: X INATTIVO

+ BrdU = COLORAZIONE PALLIDA = BANDA NEGATIVA

- BrdU = COLORAZIONE INTENSA = BANDA POSITIVA

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BrdU NELLA FASE S INIZIALE
    • INCORPORANO LE REGIONI A REPLICAZIONE PRECOCE CHE RISULTANO PALLIDE ALLA COLORAZIONE SUCCESSIVA
    • SI OSSERVA UN BANDEGGIO SOVRAPPONIBILE A QUELLO G MORFOLOGICO QUINDI LE BANDE R (G NEGATIVE) SONO A REPLICAZIONE PRECOCE
  • BrdU NELLA FASE S TERMINALE
    • INCORPORANO LE REGIONI A REPLICAZIONE TARDIVA CHE RISULTANO PALLIDE ALLA COLORAZIONE SUCCESSIVA
    • SI OSSERVA UN BANDEGGIO SOVRAPPONIBILE A QUELLO R MORFOLOGICO, QUINDI LE BANDE G (R NEGATIVE) SONO A REPLICAZIONE TARDIVA
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BANDA G/Q

RICCO IN A-T

> CONDENSAZIONE

< CONCENTRAZIONE DI GENI

A REPLICAZIONE TARDIVA

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BANDA R

RICCO IN G-C

< CONDENSAZIONE

> CONCENTRAZIONE DI GENI

A REPLICAZIONE PRECOCE

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BANDEGGIO RBG

G2 3h

  • ESPOSIZIONE DELLE CELLULE A BrdU PER LE ULTIME 7 ORE PRIMA DELL'ALLESTIMENTO DEL PREPARATO
  • LE ZONE A REPLICAZIONE TARDIVA (CONDENSATE, RICCHE IN A-T, G POSITIVE) SARANNO CHIARE, NE RISULTA UN BANDEGGIO R

M 1.5h

S 9h

BrdU 7h

G1 10.5 h

24 h

bandeggio gbg
BANDEGGIO GBG

G2 3h

  • ESPOSIZIONE DELLE CELLULE A BrdU PER TUTTO IL PERIODO DI COLTURA, LAVAGGIO E SOSTITUZIONE DI BrdU CON TIMIDINA 7 ORE PRIMA DELL'ALLESTIMENTO DEL PREPARATO
  • LE ZONE A REPLICAZIONE PRECOCE (DECONDENSATE, RICCHE IN G-C, G NEGATIVE) SARANNO CHIARE, NE RISULTA UN BANDEGGIO G

M 1.5h

Timidina 7h

S 9h

BrdU 17h

G1 10.5 h

24 h

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COLORAZIONE FPG

Fluorochrome Photolysis Giemsa

A DIFFERENZA DELLA COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA E' UNA COLORAZIONE PERMANENTE

  • COLORAZIONE CON HOECHST 33258 (bis-benzimide)
  • LA FLUORESCENZA VIENE SMORZATA DOVE E' STATA INCORPORATA BrdU
  • ESPOSIZIONE DEI VETRINI A LUCE UV. LA LAMPADA PRODUCE CALORE
  • FOTOLISI PREFERENZIALE DELLE ZONE CON BrdU LEGATA AL FLUOROCROMO SOMMATA A DEGRADAZIONE TERMICA
  • COLORAZIONE CON GIEMSA:
    • RISULTANO PALLIDE LE REGIONI CHE HANNO INCORPORATO BrdU
    • SI COLORANO PIU' INTENSAMENTE LE REGIONI CHE NON HANNO INCORPORATO
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SCE
  • ESPONENDO LE CELLULE A BrdU PER DUE CICLI COMPLETI (2 fasi S) SI OTTIENE LA COLORAZIONE DIFFERENZIALE DEI CROMATIDI FRATELLI (SISTER CHROMATIDS DIFFERENTIATION, SCD)
  • SI DIMOSTRA L'ESISTENZA DI SCE (SISTER CHROMATIDS EXCHANGES)
  • SI PENSA CHE GLI SCAMBI FRA CROMATIDI FRATELLI SIANO DOVUTI A STRESS ROTAZIONALE ALLA FORCA REPLICATIVA (all'interfaccia bande G-R, in corrispondenza di siti fragili, punti di rottura nei tumori, minisatelliti)
  • UN AUMENTO SIGNIFICATIVO DELLA FREQUENZA DI SCE E' INDICE DI INSTABILITA' GENETICA
  • TEST DEGLI SCE USATO IN MUTAGENESI
  • ALTA FREQUENZA DI SCE IN SINDROMI DA INSTABILITA' CROMOSOMICA (SINDROME DI BLOOM)
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SCE

L’esperimento e analogo a quello di Meselson e Stall:

si dimostra che la replicazione del DNA è semicomservativa.

potere di risoluzione
POTERE DI RISOLUZIONE
  • CAPACITA’ DI DISTINGUERE OGGETTI VICINI COME ENTITA’SEPARATE
  • ATTENZIONE!!! NON SI PARLA DI INGRANDIRE SINGOLI OGGETTI, MA DI DISTINGUERE OGGETTI SEPARATI
  • POTERE DI RISOLUZIONE DELL’OCCHIO UMANO = 0,1mm
  • POTERE DI RISOLUZIONE DEL MICROSCOPIO OTTICO = 0,2m
  • POTERE DI RISOLUZIONE DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO = 0,0004m (4Å)
bandeggio ad alta risoluzione yunis 1976 dutrillaux 1976
BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONEYUNIS, 1976 DUTRILLAUX, 1976
  • L'UNITA' DI MISURA CITOGENETICA E' LA BANDA
  • LA RISOLUZIONE PUO' ESSERE AUMENTATA DIMINUENDO LA DIMENSIONE DELL’UNITA' DI MISURA
  • IL MICROSCOPIO ELETTRONICO NON AUMENTA LA RISOLUZIONE CITOGENTICA SI VEDONO PIU’ GRANDI LE BANDE, MA NON SI VEDONO PIU’ BANDE
  • SI PENSA DI PERCORRERE A RITROSO IL PROCESSO DI CONDENSAZIONE CROMOSOMICA
  • LA BANDA DEL CROMOSOMA METAFASICO SI SUDDIVIDE IN SOTTOBANDE NEL CROMOSOMA PROMETAFASICO E PROFASICO
  • DALLA BANDA METAFASICA DI 107-108bp SI PASSA ALLA BANDA PROFASICA DI CIRCA 106bp
  • IL NUMERO DI BANDE METAFASICHE PER GENOMA UMANO APLOIDE E' PARI A 400
  • IL NUMERO MASSIMO DI BANDE PROFASICHE PER GENOMA UMANO APLOIDE E' PARI A 3000
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DISPORRE DI UN NUMERO UTILE DI CELLULE METAFASICHE E’ FACILE. DAI PRIMI DEL ‘900 SI CONOSCE L’EFFETTO DELLA COLCHICINA: NON SI FORMA IL FUSO MITOTICO, LA DIVISIONE CELLULARE SI ARRESTA IN METAFASE.
  • COME SI PUO’ OPERARE PER OTTENERE UN NUMERO UTILE DI CELLULE PROMETAFASICHE O PROFASICHE?
  • SI SINCRONIZZANO LE CELLULE:
    • SI BLOCCA IL CICLO CELLULARE IN UN PUNTO PRECISO;
    • SI ATTENDE CHE TUTTE LE CELLULE ARRIVINO AL PUNTO DEL BLOCCO;
    • SI RIMUOVE IL BLOCCO IN MODO CHE TUTTE LE CELLULE DI UNA COLTURA RIENTRINO NEL CICLO A PARTIRE DALLA STESSO PUNTO;
    • SI ALLESTISCE IL PREPARATO CROMOSOMICO DOPO UN TEMPO SUFFICIENTE AFFINCHE’ LE CELLULE SI TROVINO IN PROMETAFASE O IN PROFASE.
sincronizzazione cellulare
SINCRONIZZAZIONE CELLULARE
  • STRESS:
    • TEMPERATURA (basse temperature)
    • COMPOSIZIONE DEL TERRENO (starvation, terreno senza siero)
  • INIBITORI DI FASI SPECIFICHE:
    • INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA (cloramfenicolo,…)
    • INIBITORI DELLA SINTESI DEL DNA

N.B.B. L'ARRESTO DELLA CRESCITA DEVE ESSERE VELOCEMENTE REVERSIBILE: BLOCCO

RILASCIO

i sistemi di sincronizzazione piu utilizzati in citogenetica bloccano la fase s
I SISTEMI DI SINCRONIZZAZIONE PIU' UTILIZZATI IN CITOGENETICABLOCCANO LA FASE S

BLOCCORILASCIO

METOTREXATE (MTX) TIMIDINA

BrdU

TIMIDINA 2-DESOSSICITIDINA

BrdU 2-DESOSSICITIDINA

FudR TIMIDINA

BrdU

IL PIU’ DIFFUSO E IL PIU’ SEMPLICE E’:

BLOCCO MTX

RILASCIO BrdU O TIMIDINA

slide25

BLOCCO: MTX

RILASCIO: BrdU O TIMIDINA

G2 3h

MTX 17h

5.5 h PROFASE

6 h PROMETAFASE

7 h METAFASE

BrdU (Timidina) 5.5 h

6 h

7 h

S 9h

G1 10.5 h

24 h

meccanismo di azione mtx
MECCANISMO DI AZIONE MTX

DIIDRODROFOLATO

DHFR

DIIDROFOLAOREDUTTASI

MTX

TETRAIDROFOLATO

ACIDO N5, N10 METILEN-

TETRAIROFOLICO

-CH3

dUMP

dTMP

  • IN PRESENZA DI MTX SI BLOCCA LA VIA ENDOGENA DI SINTESI DEI NUCLEOTIDI, DEVE ESSERE SFRUTTATA LA VIA DI SALVATAGGIO, SI CREA UNA DIPENDENZA DAI PRECURSORI ESOGENI
  • GLI ENZIMI TK E HGPRT DIVENTANO ESSENZIALI PER LA CRESCITA
bandeggio ad alta risoluzione applicazioni
BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONEAPPLICAZIONI
  • CITOGENETICA CLINICA
    • IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI BILANCIATI
    • DEFINIZIONE DEI PUNTI DI ROTTURA DI RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI
    • CARATTERIZZAZIONE DI RIARRANGIAMENTI COMPLESSI
    • STUDIO DI SINDROMI DA GENI CONTIGUI, DISORDINI GENOMICI

X-FRAGILE X q 27-28

DOUCHENNE (DMD) X p 21

PRADER WILLI 15 q 21

ANGELMAN 15 q 21

slide28
CITOGENETICA ONCOLOGICA
    • IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI CAUSALI IN LEUCEMIE, LINFOMI, TUMORI SOLIDI
    • STUDIO DI MICRODELEZIONI ASSOCIATE A TUMORI (GENI ONCOSOPPRESSORI)

CGL (leucemia granulocitica cronica) t(9;22) c-abl

LINFOMA DI BURKITT t(8;14) c-myc

RETINOBLASTOMA del 13 q 14

TUMORE DI WILMS del 11 p 13

slide29
CITOGENETICA COMPARATA
    • RICOSTRUZIONE DELL'EVOLUZIONE DEI CARIOTIPI
    • LOCALIZZAZIONE GENICA COMPARATA
    • STUDIO DELL’EVOLUZIONE DEI CROMOSOMI DEL SESSO
  • LOCALIZZAZIONE GENICA
    • BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONE ACCOPPIATO AD IBRIDI SOMATICI
    • BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONE ACCOPPIATO AD IBRIDAZIONE IN SITU.
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G

R

G

R

G

R

G

R

G

R

G

R

slide43

BANDEGGI GTG E RBG

BANDEGGIO CBG

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I CROMOSOMI

1, 2, 3 E 4

A DIVERSI LIVELLI DI RISOLUZIONE