第十二章色谱法分析法

第十二章色谱法分析法 第一节概述第二节气相色谱理论基础第三节气相色谱法第四节高效液相色谱法第五节色谱分离方式的选择

第一节概述 色谱法（Chromatography）是一种分离分析方法，是目前科研和生产分析中广泛采用的一种重要工具。一句话，色谱法非常有用，必须掌握。一、色谱法简介色谱法是1901年由俄国植物学家茨维特（Tswett)）提出，最初的认识是在于它的分离价值，用于分离植物中的色素等有色物质。现代的色谱方法，不再局限于有色物质，也大量用于分离无色物质。

俄国植物学家茨维特使用的装置：色谱原型装置如图，用来分离植物叶片中的色素。俄国植物学家茨维特使用的装置：色谱原型装置如图，用来分离植物叶片中的色素。管子中的填充物，固定不动，称为固定相（碳酸钙）；将色素提取物置于管子上端，靠重力往下流，同时用石油醚淋洗；石油醚称为流动相（携带试样混合物流过固定相）。管子及填充物可以称为色谱柱。色谱三元素！叶绿素A 叶黄素胡萝卜素

色谱分离原理： 当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分在固定相中停留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。

这种借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离的技术，称为色谱分离技术或色谱法。这种借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离的技术，称为色谱分离技术或色谱法。二、色谱法分类 1、按两相物理状态分类气相色谱（气体作流动相），气－固色谱、气－液色谱液相色谱（液体作流动相），液－固色谱、液－液色谱固定相状态流动相状态

2、按固定相的形式分类 柱色谱：固定相装在色谱柱中，分：填充柱色谱和毛细管色谱。纸色谱：以多孔滤纸为载体，以吸附在滤纸上的水为固定相薄层色谱：以涂渍在玻璃板或塑料板上的吸附剂粉末制成薄层作固定相

3、按分离过程中物理化学原理分类 吸附色谱：吸附剂表面对不同组分的物理吸附性能差异分配色谱：不同组分在两相中有不同的分配系数离子交换色谱：利用离子交换原理排阻色谱：利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用按其它原理：凝胶色谱超临界流体色谱高效毛细管电泳

三、色谱法的特点 （1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高可以检测出10-6～10-9g的物质。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广几乎所有的化学物质。不足之处：被分离组分（未知物）的定性较为困难。

色谱柱 检测器记录仪载气 A＋B 载气载气载气载气三、气相色谱分离过程及有关术语 1、气相色谱分离过程

2、气相色谱常用术语 色谱图（色谱流出曲线）试样中的各组分经色谱柱分离后，随载气依次进入检测器，检测器将各组分浓度的变化转换为电信号，在记录仪上记录为检测器响应随时间的变化的微分曲线，称为色谱流出曲线。

（1）色谱峰 组分从色谱柱流出，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。特点：当进样少，组分浓度低时，呈高斯分布

（2）基线 在正常操作条件下，仅用载气通过色谱柱时，检测器响应信号随时间变化的曲线称为基线。 Base line 特点：稳定的基线应为平行于横轴的直线。

h （3）色谱峰高色谱峰顶点到基线的垂直距离（高度）称为色谱峰高。

2σ 0.607h （4）色谱峰的区域宽度色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可以反映色谱柱的分离效能。在能够将组分分开的情况小，峰的区域宽度越窄越好。度量色谱峰的区域宽度通常有三种方法：（i）标准偏差σ：它是0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半(EF/2) E F

G H h/2 （ii）半高峰宽W1/2：峰高一半处对应的色谱峰宽(GH)　 W1/2＝2.354σ

I J Wb （iii）色谱峰底宽Wb：色谱峰两侧拐点作切线与基线交点间的距离(IJ)。 Wb＝4σ

保留时间tR 保留体积VR （5）保留值试样各组分在色谱柱中保留行为的量度。它反映了组分与固定相之间相互作用的大小

（i）保留时间tR：试样从进样开始到柱后出现峰极大值所需的时间。相应于试样到达柱末端的检测器所需的时间。（i）保留时间tR：试样从进样开始到柱后出现峰极大值所需的时间。相应于试样到达柱末端的检测器所需的时间。

t0 （ii）死时间t0：不被固定相保留（吸附或溶解）的气体的组分（如空气和甲烷）从进样到色谱图上出现峰最大值所需的时间。

（iii）调整保留时间tRˊ： 扣除死时间后的保留时间 tRˊ＝tR－t0 (iv)保留体积 VR：指从进样到出现某组分的色谱峰最大值时所通过载气的体积。若色谱柱出口处载气的流量为F0（ml/min），则 VR＝tRF0 （v）死体积V0：死时间内通过色谱柱载气的体积　　　　V0＝tMF0 V0：实际上是色谱柱内载气所占的体积。

（vi）调整保留体积VRˊ： VRˊ＝VR－V0 （vii）相对保留值γ2.1：在相同操作条件下，两组分的调整保留值之比。

讨论： • γ2.1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据； • γ2.1是调整保留值之比，而不是保留值之比； • 可表示色谱柱的选择性， γ2.1越大，两组分的tR’值相差越大，越易分离；当γ2.1＝1时，重叠。 • 保留值又是色谱分离过程热力学性质的重要参数；

从色谱流出曲线，可以得到许多重要信息（P211）从色谱流出曲线，可以得到许多重要信息（P211）（1）色谱峰数目——可以判断试样中所含组分的最少个数。（2）色谱峰保留值（或位置）——可以进行定性分析。（3）色谱峰下的面积或峰高——可以进行定量分析。（4）色谱峰的保留值及其区域宽度——是评价色谱柱分离效能的依据。（5）色谱峰两峰间的距离——是评价固定相和流动相选择是否合适的依据。

第二节气相色谱理论基础

色谱分离原理 色谱法实质是一种物理化学的分离方法。它是根据混合物各组分在互不相溶的两相——固定相和流动相中具有不同的吸附能力、分配系数或其它亲和作用的性质作为分离依据，当两相作相对运动时，组分在两相中反复多次分配，这样就使得那些吸附能力或分配系数只有微小差别的物质，在移动速度上产生了较大差别，从而达到完全分离。色谱是一种分离技术，要把复杂的试样中各个组分分开为目的！

A A B B 如某A、B两个组分的试样要使两组分完全分开，必须满足（1）相邻两个组分分开的距离要明显，也就是说两个组分的保留值要有明显的区别。（2）色谱峰的区域宽度：要窄。区域扩宽的速率应小于区域分离的速率，

B A 作为一个色谱理论，应研究这两个方面：（1）组分在柱中移动的速率；（2）组分在移动过程中区域变宽的程度及其影响因素。

一、塔板理论（plate theory) （以气－液色谱为例） 1。分配平衡：塔板理论又称平衡理论，也就是说色谱过程可以看成是组分在流动相和固定相之间的分配平衡过程。 Amobile Astationary （1）分配系数K：在一定温度、压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K表示，即：

分配系数 一定温度下，组分的分配系数K越大，即在液相中的浓度大（在液相中停留的时间长），出峰越慢； • 试样一定时，K主要取决于固定相性质，选择适宜的固定相可改善分离效果； • 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同，试样中的各组分具有不同的K值是色谱分离的基础； • 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。

（2）分配比k：在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相中的质量之比，称为分配比，用k表示，即：（2）分配比k：在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相中的质量之比，称为分配比，用k表示，即：

分配比k和分配系数K之间的关系： 其中：l：液相；g：气相；m：质量；C：浓度；V：体积

讨论： • 影响因素：柱温、柱压； • K与V无关，而k与固定液的体积又关（Vl) ； • 分配比k越大，组分在固定液中的量越多，相当于柱的容量越大，故k又称容量因子； • 与保留值的关系; • 当某一组分的色谱峰最高点出现时，说明该组分恰好有一半的量洗脱在的流动相中刚好流出柱子（体积VR），其余一半则留在柱内，即留在柱内的流动相（体积为Vg）和固定相（体积为Vl）中，根据物料等衡原理：

调整保留体积V’R与分配系数成正比。是色谱过程的基本方程，将反映色谱行为的保留值（VR、V0、VR’）与反映物质性质的热力学常数K联系起来。调整保留体积V’R与分配系数成正比。是色谱过程的基本方程，将反映色谱行为的保留值（VR、V0、VR’）与反映物质性质的热力学常数K联系起来。

容量因子k是调整保留时间和死时间之比，即表示溶质分子花费在固定相中的时间比在流动相中长多少倍。容量因子k是调整保留时间和死时间之比，即表示溶质分子花费在固定相中的时间比在流动相中长多少倍。某组分的k越大，保留时间越长，反之亦然。

（3）色谱基本保留方程（气液色谱）： 色谱柱确定后，Vg和Vl即为定值，分配系数K不同的组分保留值不同，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。

2。塔板理论（plate theory) ： （1）塔板模型：将色谱柱假想为一个精馏塔，色谱柱中的固定相形象化为一系列连续的、相等体积的塔板。每一块塔板的高度称理论塔板高度H（板高）。精馏塔模型

将色谱分离过程比作蒸馏过程，直接引用处理蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱过程，即将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。将色谱分离过程比作蒸馏过程，直接引用处理蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱过程，即将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。

（2）塔板理论的假设： （i）在每一块塔板上被分离组分在两相（气液）间很快达到平衡，然后随载气一个塔板一个塔板的方式向前移动。对于一根柱长为L的色谱柱，则组分在柱中达到平衡的次数n为： n=L/H n——称为理论塔板数，H为每一块塔板的高度。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小;

（ii）载气（流动相）进入色谱柱，不是连续的而是脉动式的，每次进气为一个塔板体积；（ii）载气（流动相）进入色谱柱，不是连续的而是脉动式的，每次进气为一个塔板体积；（iii）试样开始时都加在第0号塔板上，且试样沿色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略不计；（iv）分配系数在各塔板上是常数。

（3）塔板理论的内容： （i）当组分在柱中的平衡次数，即理论塔板数n≥50时，可得到基本对称的峰形曲线。对于气相色谱，n约为103～106，流出曲线趋近正态分布曲线。（ii）试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，可获得良好的分离。（iii）由塔板理论可导出n与半峰宽度或峰底宽度的关系：

讨论： （i） tR一定时，峰宽越小，说明n越大（H越小），色谱柱的效能越高（柱效）。（ii）同一色谱柱，采用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。（iii）在实际工作中，从上述两式计算出的n和H并不能充分反映柱效，因为采用tR，没有扣除死时间，因为组分在t0时间内不参与柱内分配。有时候n尽管很大，但色谱柱的分离效果并不好，需引入有效塔板数和有效塔板高度：

注意： 由于同一根色谱柱对不同组分的neff不一样，在评价色谱柱柱效时，要注明是什么物质，也要注明柱温、柱压。例1：已知某组分峰Wb＝40s，tR=400s。计算理论塔板数n. 例2：已知一根1米长的色谱柱，neff＝1600块，组份A在柱上的调整保留时间为100s，试求A峰的半峰宽和Heff。

（4）塔板理论的成功与局限： 成功：（i）定量地说明了组分在色谱柱中的移动速率；（ii）解释了流出曲线的形状；（iii）提出了计算和评价柱效能高低的常数。局限：（i）只能定性地给出H的概念，不能解释H受哪些因素的影响;（ii）排除了一个重要参数——流动相的速度u，因而无法解释柱效与流速关系，更无法提出降低板高的途径（不能说明在不同流速下，可以测得不同的理论塔板数）。（iii）做出了四个与实际不相符的假设，没有考虑组分在柱中受到的动力学因素的影响：如扩散，传质阻力等，不能解释色谱峰变宽的原因。

二、速率理论（ rate theory) ： 为了解决塔板理论所不能解决的问题，1956年荷兰学者范第姆特（ Van Deemter）提出了速率理论。（气液色谱为例）。内容要点：吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，定量地解释了影响塔板高度的各种因素，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系(u＝L/t0)：

其中：A、B、C为常数，分别代表涡流扩散项、分子扩散系数和传质阻力系数 。上式即为范第姆特方程式的简化式。由此式可见影响H的三项因素：涡流扩散项、分子扩散项和传质阻力项。在u一定时，只有A,B,C较小时，H才能较小，柱效才能较高，反之则柱效较低，色谱峰将扩张。

无阻力－平流 有阻力－涡流 1、涡流扩散项A 什么叫涡流？

在填充柱中，当组分随流动相（载气）通过填充物向柱出口处迁移时，碰到填充物颗粒的阻碍，其流动方向不断地改变，形成类似“涡流”的流动。由于填充物的大小、形状不同及填充的不均匀性，使组分各分子在色谱柱中经过的通道直径和长度不等，造成它们在柱中的停留时间不同，使色谱峰变宽。在填充柱中，当组分随流动相（载气）通过填充物向柱出口处迁移时，碰到填充物颗粒的阻碍，其流动方向不断地改变，形成类似“涡流”的流动。由于填充物的大小、形状不同及填充的不均匀性，使组分各分子在色谱柱中经过的通道直径和长度不等，造成它们在柱中的停留时间不同，使色谱峰变宽。

结果：峰变宽。 影响因素：（1）填充物的大小、形状（2）填充的均匀程度，空隙的规则 dp：固定相的平均颗粒直径； λ：固定相的填充不均匀因子。固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。

色谱柱的轴向 2、分子扩散项B/u：B为分子扩散项系数样品被载气带入色谱柱后，是以“塞子”的形式存在于色谱柱内很小的一段空间。组分在轴向上（纵向）存在浓度梯度，导致组分分子产生浓差扩散，导致峰变宽。方向：沿色谱柱的轴向（纵向） B的影响因素：（1）柱内填充物（2）组分在气相中的扩散系数

B = 2γDg γ ：弯曲因子，反映柱填充物对分子扩散的阻碍程度，一般γ<1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）关于Dg：（1）不同组分的Dg不同（2）柱温和柱压变化会导致同一组分的Dg变化（3）与载气的相对分子质量有关：Dg ∝（M载气）-1/2

第十二章 色谱法分析法