Isolace enzymů

1. Isolace enzymů

2. Proč isolovat enzymy? • Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu • Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou • Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy  degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory  snížení aktivity cílových enzymů) • V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina  urokinasa, streptokinasa ...)

3. Zdroje enzymů • Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny • Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu ...) Selekce bakteriálních producentů amylas

4. Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...) - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou)

5. Živočišné zdroje • Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci • Jateční zvířata – orgány, krev • Člověk – tělní tekutiny (krev  plasmin, thrombin ...; moč  urokinasa ...) • Bezobratlí (hmyz, plži, mlži  málo se využívají)

6. Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek

7. Problémy se vzorkem • Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek) • Malá množství cílového enzymu • Labilita enzymu

8. Zásady pro práci s biologickým materiálem • Pokud možno zpracovat co nejdříve • V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 oC) • Rozmrazování – co nejrychleji • Nízká teplota při isolaci • Vhodné pH + iontová síla • Vhodná koncentrace bílkoviny • Zabránění pěnění • Omezení nežádoucí proteolytické aktivity • Přídavek specifických látek (např. merkaptoethanol, EDTA ...)

9. Cíl izolace • Získání homogenní bílkoviny • Zachování biologické aktivity Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného (optimálního) úsilí

10. Distribuce enzymů • Intracelulární • V periplasmatickém prostoru • Extracelulární cytoplasma periplasma

11. Membránově vázané bílkoviny

12. Úprava biologického materiálu • Mletí (kulový mlýnek, masový strojek) • Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru) - Elvehjem-Potterův homogenizátor - třecí miska s pískem - výkonný mixer

13. Dezintegrace mikrobiálních buněk • Narušení buněčné stěny • Způsoby – fyzikální - chemické - enzymové

14. Fyzikální způsoby dezintegrace • Třecí miska + balotina, písek ... • Střídavé zmražování a roztávání • French press (protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) • X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) • Ultrazvuk • Mlýnek se skleněnými balotinami X-press

15. Chemické způsoby dezintegrace • Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu) • Osmotická lyse  erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí) • Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány) • Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)

16. Enzymové způsoby dezintegrace • Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)  rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G+), následné zředění destilovanou vodou

17. Metody isolace enzymů • Srážení (precipitace) • Membránové separační procesy • Chromatografie • Elektroforéza

18. Srážení • Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu • První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 • Filtrace nahrazena centrifugací

19. Vysolování vsolování vysolování

20. (NH4)2SO4 • Rozpustnost se málo mění s teplotou • Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) • Levný • Stabilizuje bílkoviny • Relativně čistý

21. Srážení - dvojstupňově

22. Provedení pevný (NH4)2SO4 nebo saturovaný roztok (NH4)2SO4 Chlazení Míchání 10-30’ Centrifugace úprava pH NH4OH El. míchačka

23. Srážení organickými rozpouštědly • Kompletně mísitelné s vodou • Nereagují s bílkovinou • Musí mít dobrý precipitační efekt • Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!! • Možné dvoustupňové srážení EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

24. Srážení organickými polymery a sloučeninami Princip identický jako srážení s rozpouštědly • DEAE dextran • PEG • Polyakrylová kyselina • Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát) • Kaprylová kyselina

25. Srážení selektivní denaturací • Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla • Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat

26. Tepelná denaturace • Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin • pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno • Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

27. Membránové separační metody • Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul • Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku • Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

28. Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

29. Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza

30. Chromatografické metody – základní rozdělení • Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a stacionární fáze • Mobilní fáze  kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie) • Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry • Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní • Nejčastěji sloupcová chromatografie • Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie

31. Instrumentace pro LPC • Pumpa – peristaltická nebo gravitace • Gradient – mísič gradientu • Dávkování – přímo pumpou na kolonu • Kolony – skleněné • Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm • Vyhodnocování – zapisovač • Sběrač frakcí – programovatelný

32. Částice sorbentu

33. Chromatografické metody pro separaci proteinů • Gelová chromatografie • Ionexová chromatografie • Chromatografie s hydrofóbní interakcí • Afinitní chromatografie

34. Gelová chromatografie • Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru • Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina • Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu  nemísitelnost s mobilní fází • Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později • Isokratická eluce • Objem vzorku < 2 % objemu kolony • Chromatografické materiály  zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid • Možnost stanovení molekulových hmotností • Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

35. Gelová permeační chromatografie

36. Gelová permeační chromatografie Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula

37. Ionexová chromatografie • Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj • Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje • V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! • Celulosové a dextranové ionexy

38. Ionexy • Katexy – záporný náboj vazba kationtů silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO- • Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

39. Ionexová chromatografie proteinů • Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny • pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu • pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu • pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

40. Ionexová chromatografie • Nanášení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – gradientová • Zvyšováním iontové síly • Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

41. Typická ionexová chromatografie 1M Loading ends, Low salt wash begins Salt gradient 0 Protein absorbance II III Salt gradient ends Salt gradient begins Peak of unbound protein Loading starts I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

42. Chromatografie s hydrofobní interakcí • Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny  intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl) • Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby) • Interakci podporuje vysoká iontová síla

43. Hydrofobní chromatografie • Stacionární fáze – - C8,-fenyl • Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH4)2SO4) • Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

44. Afinitní chromatografie - princip • Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu  látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické) • Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce • Látka navázaná na nosič  afinitní ligand • Vazba ligandu přes raménko (spacer)

45. Předpoklady pro vznik komplexu • Sterické – použití raménka (spacer) • Optimální pH, iontová síla

46. Předpoklady pro vznik komplexu • Vazebné • Konformační

47. Afinitní páry

48. Interakce mezi DNA a endonukleasou

49. Afinitní chromatografie 1. Analog substrátu Enzym Afinitní ligand + NosičRaménko Enzym vázaný v aktivním místě 2. Imunoafinitní chromatografie Protilátka Proteinový epitop + NosičRaménko Enzym vázaný na protilátku

50. Provedení • Nanesení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)