slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Isolace enzymů PowerPoint Presentation
Download Presentation
Isolace enzymů

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 62

Isolace enzymů - PowerPoint PPT Presentation


  • 181 Views
  • Uploaded on

Isolace enzymů. Proč isolovat enzymy?. Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Isolace enzymů' - orenda


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
pro isolovat enzymy
Proč isolovat enzymy?
  • Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu
  • Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou
  • Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy  degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory  snížení aktivity cílových enzymů)
  • V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina  urokinasa, streptokinasa ...)
zdroje enzym
Zdroje enzymů
  • Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny
  • Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu ...)

Selekce bakteriálních producentů amylas

mikroorganismy
Mikroorganismy

Bakterie, kvasinky, plísně, řasy

Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...)

- selekce mutantů o požadovaných vlastnostech

- genetické inženýrství

- termofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou)

ivo i n zdroje
Živočišné zdroje
  • Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci
  • Jateční zvířata – orgány, krev
  • Člověk – tělní tekutiny (krev  plasmin, thrombin ...; moč  urokinasa ...)
  • Bezobratlí (hmyz, plži, mlži  málo se využívají)
rostlinn tk n
Rostlinné tkáně

Špenát, řepa, hrách

Nevýhoda – problematický růst za

definovaných podmínek

probl my se vzorkem
Problémy se vzorkem
  • Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek)
  • Malá množství cílového enzymu
  • Labilita enzymu
z sady pro pr ci s biologick m materi lem
Zásady pro práci s biologickým materiálem
  • Pokud možno zpracovat co nejdříve
  • V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 oC)
  • Rozmrazování – co nejrychleji
  • Nízká teplota při isolaci
  • Vhodné pH + iontová síla
  • Vhodná koncentrace bílkoviny
  • Zabránění pěnění
  • Omezení nežádoucí proteolytické aktivity
  • Přídavek specifických látek (např. merkaptoethanol, EDTA ...)
c l izolace
Cíl izolace
  • Získání homogenní bílkoviny
  • Zachování biologické aktivity

Závěr : získat vzorek o patřičné

čistotě s vynaložením

patřičného (optimálního) úsilí

distribuce enzym
Distribuce enzymů
  • Intracelulární
  • V periplasmatickém prostoru
  • Extracelulární

cytoplasma

periplasma

prava biologick ho materi lu
Úprava biologického materiálu
  • Mletí (kulový mlýnek, masový strojek)
  • Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru)

- Elvehjem-Potterův homogenizátor

- třecí miska s pískem

- výkonný mixer

dezintegrace mikrobi ln ch bun k
Dezintegrace mikrobiálních buněk
  • Narušení buněčné stěny
  • Způsoby – fyzikální

- chemické

- enzymové

fyzik ln zp soby dezintegrace
Fyzikální způsoby dezintegrace
  • Třecí miska + balotina, písek ...
  • Střídavé zmražování a roztávání
  • French press (protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)
  • X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)
  • Ultrazvuk
  • Mlýnek se skleněnými balotinami

X-press

chemick zp soby dezintegrace
Chemické způsoby dezintegrace
  • Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu)
  • Osmotická lyse  erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí)
  • Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány)
  • Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)
enzymov zp soby dezintegrace
Enzymové způsoby dezintegrace
  • Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)  rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G+), následné zředění destilovanou vodou
metody isolace enzym
Metody isolace enzymů
  • Srážení (precipitace)
  • Membránové separační procesy
  • Chromatografie
  • Elektroforéza
sr en
Srážení
  • Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu
  • První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4
  • Filtrace nahrazena centrifugací
vysolov n
Vysolování

vsolování

vysolování

nh 4 2 so 4
(NH4)2SO4
  • Rozpustnost se málo mění s teplotou
  • Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3)
  • Levný
  • Stabilizuje bílkoviny
  • Relativně čistý
proveden
Provedení

pevný (NH4)2SO4

nebo

saturovaný roztok

(NH4)2SO4

Chlazení

Míchání 10-30’

Centrifugace

úprava pH

NH4OH

El. míchačka

sr en organick mi rozpou t dly
Srážení organickými rozpouštědly
  • Kompletně mísitelné s vodou
  • Nereagují s bílkovinou
  • Musí mít dobrý precipitační efekt
  • Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!!
  • Možné dvoustupňové srážení

EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

sr en organick mi polymery a slou eninami
Srážení organickými polymery a sloučeninami

Princip identický jako srážení s rozpouštědly

  • DEAE dextran
  • PEG
  • Polyakrylová kyselina
  • Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát)
  • Kaprylová kyselina
sr en selektivn denaturac
Srážení selektivní denaturací
  • Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu.
  • Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla
  • Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat
tepeln denaturace
Tepelná denaturace
  • Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin
  • pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno
  • Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza
membr nov separa n metody
Membránové separační metody
  • Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul
  • Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku
  • Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin
ultrafiltrace
Ultrafiltrace

Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

chromatografick metody z kladn rozd len
Chromatografické metody – základní rozdělení
  • Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a stacionární fáze
  • Mobilní fáze  kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie)
  • Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry
  • Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní
  • Nejčastěji sloupcová chromatografie
  • Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie
instrumentace pro lpc
Instrumentace pro LPC
  • Pumpa – peristaltická nebo gravitace
  • Gradient – mísič gradientu
  • Dávkování – přímo pumpou na kolonu
  • Kolony – skleněné
  • Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm
  • Vyhodnocování – zapisovač
  • Sběrač frakcí – programovatelný
chromatografick metody pro separaci protein
Chromatografické metody pro separaci proteinů
  • Gelová chromatografie
  • Ionexová chromatografie
  • Chromatografie s hydrofóbní interakcí
  • Afinitní chromatografie
gelov chromatografie
Gelová chromatografie
  • Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru
  • Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina
  • Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu  nemísitelnost s mobilní fází
  • Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později
  • Isokratická eluce
  • Objem vzorku < 2 % objemu kolony
  • Chromatografické materiály  zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid
  • Možnost stanovení molekulových hmotností
  • Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)
gelov permea n chromatografie1
Gelová permeační chromatografie

Pořadí eluce :

největší>střední>nejmenší

molekula

ionexov chromatografie
Ionexová chromatografie
  • Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj
  • Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje
  • V případě proteinů hraje zásadní roli pH !
  • Celulosové a dextranové ionexy
ionexy
Ionexy
  • Katexy – záporný náboj vazba kationtů

silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3-

slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO-

  • Anexy – kladný náboj  vazba aniontů

slabé – diethylaminoethyl (DEAE)

silné – triethylaminoethyl (TEAE)

ionexov chromatografie protein
Ionexová chromatografie proteinů
  • Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny
  • pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu
  • pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu
  • pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii
ionexov chromatografie1
Ionexová chromatografie
  • Nanášení vzorku – nízká iontová síla
  • Eluce – gradientová
      • Zvyšováním iontové síly
      • Změnou pH

Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

typic k ionex ov chromatografie
Typická ionexová chromatografie

1M

Loading ends,

Low salt wash begins

Salt gradient

0

Protein absorbance

II

III

Salt gradient

ends

Salt gradient

begins

Peak of

unbound

protein

Loading starts

I

Eluted peaks of weakly bound (I),

moderately bound (II)

and tightly bound (III) proteins

chromatografie s hydrofobn interakc
Chromatografie s hydrofobní interakcí
  • Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny  intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl)
  • Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby)
  • Interakci podporuje vysoká iontová síla
hydrofobn chromatografie
Hydrofobní chromatografie
  • Stacionární fáze – - C8,-fenyl
  • Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH4)2SO4)
  • Eluce – snižováním iontové síly

Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

afinitn chromatografie princip
Afinitní chromatografie - princip
  • Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu  látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické)
  • Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce
  • Látka navázaná na nosič  afinitní ligand
  • Vazba ligandu přes raménko (spacer)
p edpoklady pro vznik komplexu
Předpoklady pro vznik komplexu
  • Sterické – použití raménka (spacer)
  • Optimální pH, iontová síla
p edpoklady pro vznik komplexu1
Předpoklady pro vznik komplexu
  • Vazebné
  • Konformační
afinit n chromatogra fie
Afinitní chromatografie

1. Analog substrátu

Enzym

Afinitní

ligand

+

NosičRaménko

Enzym vázaný v aktivním místě

2. Imunoafinitní chromatografie

Protilátka

Proteinový epitop

+

NosičRaménko

Enzym vázaný na protilátku

proveden1
Provedení
  • Nanesení vzorku – nízká iontová síla
  • Eluce – selektivní - volným ligandem

– neselektivní - změna pH, iontové

síly, polarity

Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)

chromatografie na imobilizovan ch barvivech
Chromatografie na imobilizovaných barvivech
  • Dye-binding chromatografie
  • Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích
  • Barviva částěčně podobná některým kofaktorům
  • Isolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin)
metal chelate chromatografie
Metal chelate chromatografie
  • Chelatující skupiny navázané na chromatografické nosiče  vazba iontů těžkých kovů (např. Ni2+)
  • Interakce kovových iontů s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu
  • Isolace rekombinantních proteinů s His6 částí
chromatofokusace
Chromatofokusace
  • Použití ionexových chromatografických materiálů pro separaci podle isoelektrických bodů
  • Kolona s vhodným ionexem je ekvilibrována v pufru o vysokém pH (vyšší než IEB cílové bílkoviny), vzorek je nanesen v témže pufru, poté je kolona promývána pufrem o nízkém pH obsahujícím amfolyty. Při průchodu pufru s amfolyty kolonou se vytváří pohybující se gradient pH. Proteiny se v koloně rozdělují podle hodnot isoelektrického bodu.
magnetick separa n techniky
Magnetické separační techniky
  • Imobilizace afinitních ligandů nebo iontově výměnných skupin na magnetické nosiče
  • Magnetické sorbenty připravené z biopolymerů vykazujících specifitu k cílovému proteinu
  • Vsádková separace cílových proteinů
  • Výhoda – možnost práce v obtížně manipulovatelných systémech (např. suspenze kultivační média, homogenáty buněk ...)
  • Možnost isolace cenných biologicky aktivních látek ze sekundárních surovin (odpadů)

BioMagn. Res. Technol. 2 (2004) 7

http://www.biomagres.com/content/pdf/1477-044X-2-7.pdf

z kladn z sady
Základní zásady
  • Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu
  • Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná

 ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší

  • Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace  možné snížení výtěžku)
  • Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat
  • Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu
z kladn z sady typick p klady
Základní zásady (typické příklady)
  • Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí
  • Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou)  chromatografie s hydrofóbní interakcí
  • Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)
nevhodn kombinace
Nevhodné kombinace
  • Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok  dialýza, ultrafiltrace)
e le k tro foresa
Elektroforesa
  • Proteiny se pohybují v nosiči (obvykle polyakrylamidový gel) vlivem elektrického pole
  • Pohyb proteinu závisí na
    • Náboji proteinu a jeho molekulové hmotnosti
    • Intenzitě elektrického pole
    • Typu a porozitě gelu
  • Různé typy (PAGE, SDS-PAGE)
  • Význam: kontrola čistoty separovaného proteinu
page e le k tro foresa
PAGE elektroforesa
  • Polyakrylamid o různé velikosti pórů použit jako nosič
  • Proteiny jsou rozpuštěny v zásaditém pufru
  • V elektrickém poli se proteiny pohybují směrem k anodě
sds e le k tro foresa
SDS elektroforesa
  • SDS denaturuje všechny typy proteinů
  • Váže se na proteiny v konstantním poměru (1 molekula SDS na 2 aminokyselinové zbytky) všechny proteiny získají vysoký záporný náboj separace probíhá pouze podle velikosti molekulové hmotnosti
sledov n istoty protein
Sledování čistoty proteinů
  • Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu
  • Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou hmotnost isolovaného proteinu (SDS elektroforesou)

Nenavázané proteiny

Eluované proteiny

Původní vzorek

Standardy