Elektroforéza

1. Elektroforéza fyzikálno-chemická metóda na separáciu látok nesúcich elektrické náboje látky sa vystavia pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k pohybu molekúl ich pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia (napríklad charakter nosiča) a sily elektrického poľa delenie nukleových kyselín a proteínov pri separácii látok sa používajú ako nosiče najčastejšie agarózové a polyakrylamidové gély gély majú charakter molekulových sít, čo umožňuje, aby sa pri elektroforéze rozdelili aj látky, ktoré majú rovnaký náboj, ale rozličnú veľkosť molekúl podľa príslušného gélu rozlišujeme elektroforézu agarózovú a polyakrylamidovú (PAGE)

2. Elektroforéza v agarózovom géli • separácia a identifikácia NK • delenie fragmentov DNA s veľkosťou ~ 20 – 20 000 bp s rozlíšením ~ 5 bp (špeciálne typy agarózy, vo väčšine prípadov je rozlíšenie viac ako 5 bp) • molekuly DNA sa pohybujú (DNA je záporne nabitá) v agarózovom géli od záporne nabitej katódy ku kladne nabitému pólu (k anóde) • separujú sa na základe ich veľkosti (bázových párov) – malé molekuly DNA sa pohybujú rýchlejšie, veľké pomalšie

3. agaróza je lineárny polymér D-galaktózy a galaktózového derivátu (3,6-anhydro-L-galaktózy), ktorý sa získava purifikáciou agaru (výťažok z červených rias) • pri príprave gélu sa agaróza rozpúšťa v horúcich tlmivých roztokoch (napríklad Tris-borátový alebo Tris-acetátový tlmivý roztok) • ak teplota klesne pod 45 °C, vzniká polotuhý gél • základné zariadenie na elektroforézu sa skladá z elektroforetickej komory a zdroja jednosmerného elektrického prúdu • elektroforetická komora má katódový a anódový priestor s elektrolytom a priestor na umiestenie nosiča

4. vzorka DNA sa do gélu nanáša zmiešaná s farbivom (brómfenolová modrá, xyléncyanolová zelená)

6. do gélu sa pridáva interkalačné činidlo, ktoré sa počas migrácie DNA začleňuje medzi dusíkaté bázy DNA a po elektroforéze umožňuje pozorovanie jednotlivých fragmentov separovanej DNA v UV svetle • vizualizácia DNA – pomocou fluoreskujúceho farbiva – etídiumbromid(EtBr) • komplex EtBr s DNA po ožiarení UV lúčmi fluoreskujú oranžovo • EtBr sa pridáva do agarózového gélu počas jeho prípravy • EtBr je silné mutagénne činidlo, preto pri manipulácii s gélmi a roztokmi je nevyhnutné použiť rukavice!!!

8. veľkosť separovaných DNA fragmentov sa zisťuje porovnaním s markermi molekulových hmotností - súborom fragmentov DNA so známou veľkosťou • v súčasnosti je komerčne dostupných mnoho rozličných markerov, výber vhodného markera závisí od konkrétnej aplikácie

11. Rýchlosť pohybu NK v géli závisí od niekoľkých faktorov: • veľkosť NKMenšie molekuly prechádzajú gélom rýchlejšie, ľahšie sa pohybujú v sieťovitej štruktúre gélu. Veľkosť jednotlivých prúžkov možno odčítať zo štandardu molekulových hmotností. Pri začiatku gélu sa DNA pohybuje pomalšie ako pri jeho konci, takže vzdialenosti medzi jednotlivými prúžkami v DNA ladderi nie sú proporcionálne. • konformácia NKSekundárne štruktúry DNA ťažšie prechádzajú gélom.

12. forma NKSuperšpiralizované plazmidy sa pohybujú v géli pomalšie ako relaxované kruhové formy, pričom najrýchlejšie sa v géli pohybuje lineárna forma DNA. • koncentrácia géluHustejší gél vytvára aj hustejšiu sieťovitú štruktúru, ktorá sa viac hodí na lepšiu separáciu menších fragmentov. • napätie elektroforetickej aparatúryČím vyššie je napätie, tým rýchlejšie prebieha separácia, ale zároveň sa tým uvolňuje viac tepla, ktoré zohrieva aparatúru a môže interferovať s delením. Vyššie napätie môže byť aj príčinou "rozmazaných" prúžkov.