ทบทวนความรู้ การสอบปฏิบัติการครั้งที่ 1

1. ทบทวนความรู้การสอบปฏิบัติการครั้งที่ 1 Qualitative analysis Quantitative analysis

2. Qualitative analysis

3. xylose glucose fructose lactose sucrose (monosaccharide) (disaccharide) BIOCHEMICALANALYSIS • Qualitative (คุณภาพวิเคราะห์) identifythecomponentsof a substanceormixture. e.g. Barfoed’s test (test for monosaccharides)

4. Lab Carbohydrate chemistry

12. Lab Protein chemistry

13. ทดสอบสารที่มีหมู่ NH2 เสรี เช่น AÂ, โปรตีน และสาร amine Ninhydrin test ผลบวกคือ - สารละลายสีม่วง - ยกเว้น prolineได้สารละลายสีเหลือง

14. ทดสอบสารที่มีpeptide bond ในอณูตั้งแต่ 2bond ขึ้นไป Biuret test ผลบวกคือ - สารละลายสีม่วง

15. Coomassie blue G-250 test ทดสอบสารโปรตีนโดยใช้ dye-binding reaction ผลบวกคือ - สารละลายสีฟ้า

16. Bromcresol purple test ทดสอบสาร albumin ผลบวกคือ - สารละลายสีเขียว -ถ้ามากเกินไปอาจกลายเป็นสีน้ำเงินได้

17. Quantitative analysis

18. BIOCHEMICAL ANALYSIS • Quantitative (ปริมาวิเคราะห์) todeterminetheamountsorproportionsofthecomponentsof a substance. e.g. ระดับน้ำตาลในพลาสมา = 105 mg/dl ระดับโปรตีนในซีรั่ม = 7.2 g/dl

19. การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ I Io Io = light intensity ก่อนผ่านสารละลาย (incident light) I = light intensity หลังผ่านสารละลาย (transmitted light) ความทึบแสง (optical density [O.D.] หรือ absorbance) = log Io/I O.D. หรือ absorbance เป็น 0 เมื่อไม่มีการดูดกลืนแสง (I = Io) O.D. หรือ absorbance > 0 เมื่อมีการดูดกลืนแสง (I < Io)

20. การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ Lambert-Beer’s law A = e l c A= absorbance หรือ optical density (O.D.) = ค่าคงที่ของการดูดกลืนแสง (extinction coefficient) l= ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย c= ความเข้มข้นของสารละลาย เมื่อ ระยะทางที่แสงผ่านคงที่ \ O.D. = constant x concentration ดังนั้น การวัดความทึบแสง สามารถใช้วิเคราะห์หาปริมาณ ของสารที่ต้องการตรวจสอบได้

21. l2 0 2 4 8 mg/ml l1 Aac Aal c= ความเข้มข้นของสารละลาย l= ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ Io I

22. การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง • เครื่องวัดความทึบแสง (spectrophotometer) • เตรียมสารละลายมาตรฐาน (standard solution) ของสาร A ที่รู้ความเข้มข้น e.g. ได้จากการชั่งสาร A และทำเป็นสารละลายที่มีความเข้มข้นที่ต้องการ เช่น 250, 500, 750, 1500 mg/dl • สารละลาย unknown ที่ต้องการวิเคราะห์

23. 1 Ds = constant x Cs 2 Du = constant xCu Cu = Du x Cs Ds Ds, Du = O.D. ของน้ำยามาตรฐานและ unknown Cs, Cu = concentration ของน้ำยามาตรฐานและ unknown การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 2 เนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่าง O.D. และ ความเข้มข้นเป็นเส้นตรง O.D. = constant x concentration อาจวัดความทึบแสงโดยใช้ standard solution เพียงค่าเดียว แล้วคำนวณหาค่าความเข้มข้นของ unknown ดังนี้

24. Cu = 0.45x 1500 mg/dl Cu = Du x Cs Ds 0.68 การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง e.g. Ds ของ standard solution 1500 mg/dl = 0.68 Du ของ unknown = 0.45 Cu = 992 mg/dl

25. Cu = Du x Cs Ds การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A ในปัสสาวะ โดยวิธีเทียบความทึบแสง วิธีการ ปัสสาวะถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่น 50 เท่าก่อนที่จะนำมาทดสอบ (ใช้ปัสสาวะ 1 ส่วน เจือจางด้วยน้ำกลั่น 49 ส่วน) นำไปวัดความทึบแสงที่ 540 nm. ผลการทดสอบDs ของ standard solution 10 mg/dl = 0.4 Du = 0.2 จงคำนวณค่าความเข้มข้นของสาร A ในปัสสาวะ • Cu = 0.2 x 10 • 0.4 • = 5 mg/dl • Dilutional factor = 50 • ดังนั้น • Cu = 5x50 = 250 mg/dl

26. การใช้เครื่องspectrophotometer

27. Io I hn การใช้เครื่องspectrophotometer การใช้ cuvette • ควรมีน้ำยาใน cuvette ~ 1/2 ของหลอด • (อย่างน้อยสุด ~ 1/3) • ก่อนใช้ cuvette ควร rinse cuvette • ด้วยน้ำยาที่จะอ่าน 1-2 ครั้ง แต่ไม่ควรใช้น้ำยา rinse มาก จนทำให้เหลือน้ำยาไม่พอสำหรับอ่าน O.D.

28. การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette • จับ cuvette ให้ถูกวิธี • ก่อนที่จะใส่ cuvette ลงในเครื่อง spectrophotometer • ให้เช็ดข้างหลอดด้วยกระดาษทิชชูให้สะอาดเสมอ

29. การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette • sample holder ของเครื่อง spectronic 20 จะมีขีด (ลูกศรชี้)ที่เป็นเครื่องหมาย • เพื่อให้ใส่ cuvette ได้ถูกต้อง โดยเครื่องหมายขีดขาวบนหลอด cuvette ต้องตรง • กับขีดบน cuvette holder

30. Good luck