Biotecnologia no Melhoramento Animal

1. Biotecnologia no Melhoramento Animal Dionéia Magda Everling Doutoranda em Zootecnia Melhoramento Genético

2. O que é isso??? É qualquer técnica que utilize organismos vivos ou suas partes, para fazer ou modificar produtos, melhorar plantas ou animais ou desenvolver microorganismos para usos específicos.

3. Amplificação reprodutiva • Reprodução animal: Limitação na capacidade natural na reprodução • Capacidade de serviço • Produção e qualidade de sêmen • Número de progênie por reprodutoras

4. Inseminação Artificial • Processo de espermatogênese: • Bovinos 61 dias; • Eqüinos 55 dias; • Ovinos 47 dias e • Suínos 39 dias; • Fatores que afetam a produção de espermatozóides • Idade • Ambiente • Níveis hormonais • Tamanho do testículo

5. Etapas da Inseminação Artificial • Seleção de machos • Informações sobre os animais ( DEP) • Coleta do sêmen • Vagina artificial • Eletro ejaculação • Métodos manuais • Avaliação do sêmen • Motilidade • Concentração • Morfologia • volume • Diluição do sêmen • Utilização do sêmen • Fresco • Refrigerado • Congelado

7. Usos da Inseminação Artificial • Melhoramento genético • Diminuir a relação macho/fêmea • Organização de Testes de progênie • Acasalamento em diferentes raças • Absorção de raças que se deseja criar • Conservação de raças em perigo de extinção • Controle de doenças • Eliminação de custos de produção e manutenção de machos no estabelecimento • Facilidade de coletas de dados sobre paternidade • Disseminação de genes superiores de animais corretamente avaliados que levam ao aumento de produção

8. Transferência de embrião (TE) • Definição: Implantar em fêmeas receptoras embriões produzidos por fêmeas doadoras (0 até 30 Embriões) • No que consiste a TE??? • Estimulação hormonal – superovulação • Inseminação Artificial ou fecundação Natural • Coleta e armazenamento de embriões • Preparação das receptoras e transferência

9. ETAPAS DA TE • Seleção de doadoras para TE • Machos e fêmeas com genótipo comprovadamente superiores • Escolha das características a serem melhoradas • Escolha das receptoras • Aspectos sanitários • Superovulação • Resposta das doadoras ( 10 -15 % não respondem) • Hormônio mais utilizado FHS

10. ETAPAS DA TE • Inseminação Artificial • 7 dias após o inicio da superovulação; • Utiliza-se sêmen congelado. • Coleta de embriões • 6-7 dias após a IA; • Recuperação de embriões (transcervical) • PBS a 25°C, Ph 7,2 • Sonda de coleta, fixada num dos cornos • Taxa embrião x corpo lúteo : 70 %

11. Etapas da TE • Isolamento e classificação de embriões • Avaliação morfológica: microscopia óptica • Observa-se • Tamanho; • Forma ; • Cor ; • Citoplasma; • Membrana pelúcida e vesículas • 6 categorias ( excelente e não fecundado)

12. Etapas da TE • Estocagem de embriões • Objetivo: Manter a viabilidade dos embriões por varias horas ou dias fora do trato reprodutivo da fêmea • A fresco: fêmeas aptas a transferência. • Congelado (Crio preservação): glicerol, etileno-glicol, ISOCRIOGEN. • Técnicas de descongelamento: Banho maria, re-hidratação

13. Etapas da TE • Sincronização do ciclo estral das receptoras • Objetivo: conseguir que as fêmeas estejam em cio no momento desejado tanto para a IA como TE. • Melhora as chances de implantação, melhora a taxa de prenhes • Hormônios utilizados: prostaglandina, progestagenos.

14. Etapas da TE • A transferência do embrião (inovulação) • Objetivo: Posicionar o embrião no útero da receptora • Técnica: Não cirúrgica ( inovulação trans-cervical) • Local da introdução do pailletes: corno uterino com deposição do embrião na junção útero-tubárica. • Resultado: 2 a 3 meses após a TE realiza-se o diagnostico de gestação nas vacas receptoras, que 9 meses após a TE darão origem a animais geneticamente semelhantes a progênie das vacas doadoras de embriões e aos touros utilizados na IA.

15. FATORES QUE AFETAM A EFICÁCIA TE: • Resposta individual de cada vaca a estimulação hormonal • Nível técnico da equipe que conduz a TE; • Escolha das técnicas da coleta e TE; • Grau de sincronização do cio entre o ciclo estral das fêmeas doadoras e receptoras; • Fertilidade natural das doadoras; • Qualidade do sêmen utilizado • Qualidade dos embriões • Nutrição e manejo dos animais OBS: Embriões normais, equipe capacitada,animais saudáveis e em época de ciclo adequados : taxa de eficiência de 50 %.

16. USOS da TE • Obtenção de maior número de progênie de fêmeas de alto valor genético; • Expansão rápida de núcleos de vacas selecionadas; • Controle na transmissão de doenças; • Comércio de embriões; • Teste de homozigose para genes dominantes. • Conservação de raças em perigo de extinção, pela crio-preservação

17. Limitações da TE • Impacto menor no melhoramento genético do que a IA; • Tecnologia complexa e mais cara; • Uso de mão de obra especializada.

18. SEXAGEM DE SEMÊN • Determinação do sexo do espermatozóide: Y ou X • Vantagens: • Melhor programação das populações • Maior ganho na produção de carne e leite • Facilidade em direcionar reposição de matrizes • Ganhos genéticos e redução de tempo na seleção de plantéis • Garantia de acurácia acima de 85% na determinação do sexo • Melhor direcionamento nos testes de progênies • Poder de decisão passa para as mãos do pecuarista • A aplicação comercial de sêmen sexado já existe no Brasil de 2004. • Atualmente a acurácia fica em torno de 90 %. • Devido ao alto custo, em relação ao sêmen não sexado, recomenda-se utilização de fêmeas com bom histórico reprodutivo, e em condições ideais de mineralização, vermifugação, vacinação e conforto

19. Fertilização IN VITRO • Definição : Embriões são produzidos fora do corpo da fêmea • Etapas: • Coleta de ovócitos na fêmea: Laparosopia • Maturação dos ovócitos in vitro; • Capacitação dos espermatozóides; • Desenvolvimento do embrião até blastocisto. • Implantaçãoes de embriões nas femeas receptoras. OBS: Eficiência da técnica até 40% (embriões viáveis / ovócito maduro)

20. Sexagem de embriões • É a disponibilidade de embriões cujo o sexo já esteja previamente determinado. • Técnica: Amplificação enzimática dirigida de DNA ( PCR), com kit comercial. • Vantagem: Produção de machos ou fêmeas de acordo com os objetivos da produção • Desvantagens: As técnicas ainda são caras e sujeita a erros

21. CLONAGEM • Definição: a clonagem é um processo de reprodução assexuada, onde são obtidos indivíduos geneticamente iguais (microorganismo, vegetal ou animal) a partir de uma célula-mãe • Ocorre de forma natural ano caso de gêmeos univitelíneos • É um meio de propagação comum em plantas, bactérias e protozoários • Ainda não existe comercialmente a venda de embriões clonados • Uso no melhoramento: Possibilidade da multiplicação de animais geneticamente superiores em larga escala. • Desvantagem no melhoramento genético: Perda da variabilidade genética, no aspecto de resistência a doenças, fatores climáticos

22. Animais trangênico • Definição : Possui em seu genoma um DNA estranho (de outra espécie geralmente), integrado de forma estável, em que se transmite a sua descendência de acordo com as leis de genética Mendeliana. • Técnica: micro manipulação ou virus: introdução, modificação ou inativação de um gene. • Aplicação no melhoramento: aumento de produção: carne, lã, resistência a doenças, e modificação de produtos (maciez da carne, nível colesterol da carne, lactose) • Limitação: técnica ainda em desenvolvimento, aceitação quanto ao consumo dos produtos, pouco connheimento sobre os efeitos na saúde humana.

23. Estudo com animais trangênicos • Suínos: bGH ( hormônio de crescimento bovino) • Vantagens: aumento do crescimento; aumento na conversão alimentar; mudança na composição da carcaça; redução da espessura de gordura subcutânea • Efeitos adversos: aumento dos níveis circulantes do plasma ( ulceras, artrites problemas cardíacos, dermatites e IR: pouco tempo de vida) • Bovino: lacto albumina ( proteína humana) • Esse leite transgênico é mais nutritivo para humanos que o leite natural, e poderia ser introduzido na alimentação de crianças com carência de nutrientes específicos .

24. Controle na produção de Animais trangênicos • Comissão do Codex alimentarius (Lei alimentar ou Código alimentar, em latim), estabelecida conjuntamente pela FAO (Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação) e pela OMS (Organização Mundial da Saúde), está trabalhando em colaboração com vários países, dentre eles o Brasil, com o objetivo de criar normas de aplicação internacional visando a segurança de alimentos produzidos a partir desses animais.

25. MARCADORES GENÉTICOS • Identificar ou etiquetar alguma coisa • 1923: feijão com ausência de cor escura no tegumento x tamanho do semente : seleção de forma indireta (tegumento claro = marcador • Qualidade de um bom marcador • Herdável • Fácil observação • Herdabilidade alta • Intimamente relacionado ao aleloque desejamos selecionar • OBS: Essas qualidades tornam mas eficientes a seleção indireta • Os marcadores genéticos podem ser morfológiocos e moleculares.

26. MARCADORES MORFOLOGICOS • Fenótipo de fácil identificação • Normalmente determinada por único alelo. • Exemplo 1: planta de milho jovem verde clara x esterilidade masculina ( fenótipo importante na produção de híbrido mas de difícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem alta probabilidade de serem herdados juntos) • Exemplo 2: cor amarela do milho x teor de vitamina (o mesmo alelo para ambas características: mais fácil selecionara pela cor) • Limitação dos marcadores morfológicos: • Ocorrência em numero reduzido • Muitas características de interesse econômico não tem marcador morfológico • Muitos marcadores que apresentam baixa herdabilidade

27. Marcadores moleculares • Marcadores de proteínas ( Produtos direto dos alelos); • Marcadores que utilizam o próprio DNA (são os próprios genes ou seqüências de DNA situadas próxima ao gene de interesse): • RFLP • PCR • AFLP • Microssatélites

28. Marcadores de proteínas -bioquímicos • Mais comuns: isoenzimas ( esterases, fosfatases, peroxidases...) • Procedimento consiste na extração e identificação da proteína. • Exemplo: Cevada izoenzima esterase x resistencia um virus ( seleção indireta) • Vantagem: • menor custo • Codominância: identifica homozigotos e heterozigotos • Limitações: • Reduzida variabilidade • Marcadores em numero reduzido

29. Marcadores que utilizam o próprio DNA • São os próprios genes ou seus vizinhos, isto é seqüências de DNA situadas próxima ao gene que se deseja marcar • Vantagens; • Grande variabilidade entre indivíduos • Numero de marcadores suficientes para marcar todos os alelos de todos os genes que se deseja marcar. • Desvantagens: • Técnicas laboratoriais mais caras, que os bioquimicos e os morfológicos

30. RFLP Significa polimorfismo de comprimentos defragmentos de restrição (obtidos por corte de fita dupla deDNA). • Isolamento do DNA dos indivíduos • Enzimas de restrição que geram milhares de fragmentos • Separação por eletroforese ( tamanhos das seqüências) • Observa-se polimorfismo entre indivíduos diferentes • Hibridização com DNA marcado radioativamante (sonda), P radioativo • Fotografia do fragmento identificado pela sonda • Admitindo-se que o fragmento de DNA identificado pela sonda esteja intimamante ligado a um alalo de interesse, pode –se selecionar esse alelo por meio desse fragmento. Assim o fragmento RFLP funciona como um marcador ou etiqueta do alelo de interesse.

31. PCR Polymerase Chain Reaction • Reação de polimerização em cadeia • É um método utilizado para amplificar, in vitro, uma seqüência específica de DNA. • Ao contrario do RFLP que marca um segmento do DNA, ocorre a síntese especifica de certos segmentos de DNA. • Como ocorre? • Utilização de um pequeno segmento: Primer (iniciador) de um segmento desejado. • Vários ciclos geram um número de seqüências idênticas de DNA.

32. AFLP • AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) Significa o Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados. O AFLP combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão com enzimas de restrição e a praticidade e velocidade do PCR. • ETAPAS • Clivagem com 2 enzimas de restrição; • Ligação de adaptadores específicos; • São sintetizados inicializadores complementares aos adaptadores; • Amplificação seletiva ( reação de PCR) • Eletroforese.

33. Microssatélites • Seqüências curtas (300 pb) • Repetições em tandem (6 a 8 nucleotídeos = mais comuns TG/AC) • Mais utilizada em mapeamento genético, devido a sua grande

34. P= G+A

35. VP = VG + VA

36. Uso de marcadores no estudo de caracteres quantitativos • Caracteres quantitativos • Controlados por vários genes de pequeno efeito • Sofrem maior influencia ambiental • Não se sabe quanto ele contribui para o fenótipo • QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caractere quantitativo identificado por marcadores moleculares. • Finalidade: determinar quanto de um caractere quantitativo é explicada por um ou mais marcadores • Como os caracteres quantitativos são medidos por meio de médias os variâncias, pode-se ter idéia da porcentagem do fenótipo do caractere que é explicado pelo marcador.

37. QTL • São regiões cromossômicas relacionadas com variação fenotípicas das características quantitativas • Limitações: • Dificuldade de avaliação dos caracteres quantitativos aliados a necessidade de ligação dos marcadores com os QTL • Dificuldade de obtenção dos próprios marcadores • Estudo difícil e trabalhoso • Obs: Há necessidade de mais pesquisas para tornar mais eficientes o emprego dos marcadores moleculares no estudo das características quantitativas