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CITOMETRIA DE FLUXO Aplicações práticas. Patrícia Cisneiros dos Santos Bióloga- UCSAL Mestranda do curso de Imunologia-UFBa. PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO. CITO METRIA FLUXO Célula Medida Movimento. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

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citometria de fluxo aplica es pr ticas

CITOMETRIA DE FLUXOAplicações práticas

Patrícia Cisneiros dos Santos

Bióloga- UCSAL

Mestranda do curso de Imunologia-UFBa

princ pios b sicos de citometria de fluxo
PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO

CITO METRIA FLUXO

Célula Medida Movimento

Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

cit metro de fluxo
CITÔMETRO DE FLUXO

CITÔMETRO DE FLUXO

SISTEMA ÓTICO

SISTEMA FLUIDO

SISTEMA ELETRÔNICO

slide6
SISTEMA FLUIDO:INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO
  • SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.
  • SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.
slide7

FOCO DO LASER

SISTEMA FLUIDO

CÂMARA DE FLUXO

CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA

slide8

LaminarFlow

Sheath

Sheath

FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH”

HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE

LOW DIFFERENTIAL PRESSURE

High Sample Pressure60µl/min

Low Sample Pressure12µl/min

LaminarFlow

Sheath

Sheath

Sample

Sample

sistema ptico
SISTEMA ÓPTICO
  • SISTEMA É COMPOSTO POR UMLASERE LENTESPARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
  • A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER.
  • UM SISTEMA DEESPELHOS ÓPTICOS EFILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.
slide10

FlowCell

FlowCell

SISTEMA ÓTICO

FACSCalibur

FL1

530/30

SSC

488/10

FL2

585/42

90/10 Beam Splitter

FL4

661/16

DM 560SP

DM 640LP

Half Mirror

670LP

FluorescenceCollection Lens

FL3

.

Beam Combiner

488 nmBlue Laser

FSC Diode

Red Diode Laser~635 nm

488/10

FocusingLens

slide11

Filtros Ópticos – coletar sinais de luz

Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido.

Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido.

Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico.

Longpass Shortpass Bandpass

460 500 540

460 500 540

460 500 540

Filtro

LP 500

SP 500

BP500/30

Detector – célula fotoelétrica

slide12

ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)

LASER

ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

sistema eletr nico
SISTEMA ELETRÔNICO
  • CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.
slide14

SISTEMA ELETRÔNICO

Amedida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro

  • Parâmetro 1 FSC
  • Parâmetro 2 SSC
  • Parâmetro 3 FL1
  • Parâmetro 4 FL2
  • Parâmetro 5 FL3
slide15

O

OH

CO2H

FLUORESCÊNCIA

O que é a fluorescência ?

Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser

Fluoresceína

 = 480 nm

 = 530 nm

Luz Fluorescente emitida

de menor energia e maior comprimento de onda

Luz Incidente de maior energía

Fluorocromo

fluoresc ncias
FLUORESCÊNCIAS
  • O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda  530 nm, que corresponde à luz verde.
  • O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda  570 nm, o que corresponde à luz laranja.
  • O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda  650 nm, o que corresponde à luz vermelha.
slide18

BLASTOS

VOLUME (FS)

POLIMORFONUCLEARES

MONÓCITOS

LINFÓCITOS

DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS

GRANULOSIDADE (SS)

DISPERSÃO

slide19

1000

800

Neutrófilos

600

Side Scatter

400

Monócitos

200

Linfócitos

0

0

200

400

600

800

1000

Forward Light Scatter

DISPERSÃO:

slide20

DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2

1000

1000

800

800

600

CD4 PE

600

SideScatter

400

400

200

200

0

0

0

200

400

600

800

1000

CD3 FITC

0

200

400

600

800

1000

Forward Light Scatter

Visão dos dados coletados

alguns marcadores
ALGUNS MARCADORES

CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos.

CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas

CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica.

CD19- presente em mais de 95% das células B.

CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico.

CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.

CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.

slide22

LEUCEMIAS

CD3

CD7

HLA DR

CD 42a

CD 61

CD19

CD33

CD13

CD14

CD34

Leucemias mielóides

CD10

CD2

CD20

CD3

CD7

CD19

CD22

CD23

CD26

CD5

Leucemias Linfociticas ou

Enfermidade residual mínima

CD3

CD7

CD2

CD19

CD5

CD56

Linfomas e Mielomas

slide23

APLICAÇÕES CLÍNICAS

- Análise da subpopulação linfocítica

- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas

- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo

- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas

- Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima

- Análise de reticulócitos

- Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna

- Detecção de anticorpos antiplaquetários

- Análise do conteúdo de DNA

- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)

- Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão

linfocitária