黑龙江生物科技职业学院

1. 黑龙江生物科技职业学院 生物制药技术 生物分离技术 主讲人：张爱华

2. 实训三、锌盐沉析法提取胰岛素 1 目的要求 2 2 实验原理 3 材料用具 操作方法 4 5 注意事项 5

3. 目的要求 了解胰岛素锌盐沉析法制备的基本原理。 掌握多肽及蛋白质类生化物质提取纯化的 基本操作技术。

4. 原理 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中。 其等电点 为5.30～5.35，在pH4.5～6.5范围内几乎不溶于水， 易溶于稀酸或稀碱溶液；在80％以下乙醇或丙酮中 溶解；在90％以上乙醇或80％以上丙酮中难溶；在 乙醚中不溶；在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液 中较为稳定。 胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。以猪（或牛）的胰 脏为原料，根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化 锌作沉析剂，可使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂 蛋白的提取液中沉淀析出。为减少含锌量，进行两次氯 化钠盐析。

5. 材料用具 冻胰脏（新鲜的牛（或猪）的胰脏在保持其腺体组织情况 下用液氮或干冰速冻） 氯化钠溶液、柠檬酸溶液、硫酸、氯化锌 、丙酮、硅藻 土、五氧化二磷、20％醋酸锌等。 • 离心机、布氏漏斗（8cm）、抽滤瓶、分液漏斗、酸度计、 • 搅拌机、不锈钢锅、搪瓷桶。

6. 预 处 理 将冻胰脏块用刨胰机刨碎成片，备用。

7. 提 取 将冻胰片100g置于不锈钢锅中，加入300m L 82％乙醇（W/W），在10～13℃加入12 mol／L硫酸，调节pH 2.8～3.0，搅拌提取40min。加入6mol／L盐酸调pH至2.0，继续搅拌提取2.5 h，离心（3000r/min）15 min，残渣加入65％乙醇150mL，用6 mol／L盐酸调pH至2.0，10～13℃搅拌提取2 h，离心（3000r/min）15 min分离残渣。合并两次提取液。

8. 碱 化 将提取液置于搪瓷桶中，然后冷至0～5℃，用浓氨水调pH 7.8～8.0，加入硅藻土（每100g胰脏加6 g），抽滤，滤液随即用混合酸（盐酸4 mL、硫酸1 mL、水4 mL）酸化至pH 2.5，待沉淀完全后虹吸清液，用尼龙布（或纱布）过滤，弃去沉淀，温度控制在0～3℃。

9. 锌 沉 析 将碱化液置于不锈钢锅中，然后在搅拌的条件下加入氯化锌溶液（每100 g胰脏加3 g氯化锌，先配成30％～50％溶液，用6 mol／L盐酸调至pH 2.5后加入），温度2～4℃，待沉淀完全后，虹吸上清液，用尼龙布（或纱布）过滤除去沉淀，清液用液氨水调pH至6.8～7.0，于5℃过夜。

10. 脱 脂 虹吸除去清液，沉淀过滤收集，溶于5倍量蒸馏水，用6 mol／L盐酸调pH 2.7～2.8，12～15℃放置。次日放出下层清液（上层脂肪再用5倍量蒸馏水洗涤，回收下层清液，作下批锌沉淀溶解用）。

11. 丙酮、 锌沉 析 将盐析物置于搪瓷桶中，然后在搅拌的条件下加入7倍量水、3倍量丙酮，用4 mol／L氨水调pH至4.5，冷至0～5℃过夜，除去沉淀（沉淀另行回收），清液用4 mol／L氨水调pH至6.0，加入20％醋酸锌（按每100 g投料加入0.03 mL），析出白色沉淀。

12. 结 晶 干 燥 过滤收集沉淀，按下列配方结晶（按每100 g投料所得沉淀物计）：2％柠檬酸0.5 mL，20％醋酸锌0.0065 mL，丙酮0.16 mL，蒸馏水稀释至1 mL。结晶液冷却至0～5℃，用4 mol／L氨水碱化至pH 8.O，过滤除去沉淀。用10％柠檬酸调至pH 6.0，搅拌结晶两天，虹吸除去清液，离心，收集结晶，用蒸馏水洗2次，丙酮洗2次，以五氧化二磷真空干燥，得成品。

13. 注意事项 • 采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。要立即深冻， • –15℃保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好。在胰脏中， • 胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10％。 2.胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏胱氨酸和 酪氨酸基团。光氧化作用能导致分子中组氨酸被破坏。超声波能 引起其非专一性降解。 3.还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素c及多数 重金属（除锌、铬、钴、镍、银、金外）都能使胰岛素失活。

14. 思考题 1．为何在胰岛素的制备中溶液的pH值不能超过8.0? 2．碱化过滤时为何加硅藻土？