发光免疫检测技术的临床应用及其应注意的问题

发光免疫检测技术的临床应用及其应注意的问题发光免疫检测技术的临床应用及其应注意的问题杨晓林　博士北京大学医学部研究员中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员国际生物发光和化学发光学会( ISBC）学术理事 Council member of scientific advisory board of International Society on Bioluminescence & Chemiluminescence

化学发光（Chemiluminescence） • 由于化学反应（通常是氧化）产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子，从而导致的发光现象。 • 生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于发光体温度升高所至，发射波长也与其温度无关

化学发光的分类 按化学反应类型 • 酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统 • 非酶促化学发光：吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统按发光持续时间 • 闪光（Flash）: 发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(In Situ Injector) 和时间积分法测量 • 辉光（Glow）: 发光时间在数十分钟以上，如： HRP-Luminol系统 AP-AMPPD系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、以速率法测量。

闪光与辉光及其测量方式的差别 闪光尖峰发光信号积分法测量辉光坪区速率法测量时间原位进样

O CO2- HRP NH H2O2+ +Photon (425nm) NH OH- N2 CO2- NH2 O NH2 增强剂（Enhancer） OH N R OH R B OH OH S R 商业化产品中常见的化学发光系统鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统

OCH3 O O- O 商业化产品中常见的化学发光系统 O O O O OCH3 OCH3 AP OPO32- O- * AMPPD及其衍生物的化学发光系统光子(477nm) +

CH3 CH3 CH3 N+ N N OH- H2O2 + H2O H+ HO HOO C=O C=O C=O O O O R R R CH3 CH3 OH N N 光子 + CO2 + + C=O O O R O 商业化产品中常见的化学发光系统吖啶酯化学发光系统

发光信号检测 光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）原理光信号光电转换器件电压或电流信号放大主要特点 • 结构简单、性能稳定 • 但灵敏度低、线性范围较窄。

单光子计数器是目前高灵敏度 发光分析仪的核心部件在各打拿极之间得到能量和数目的倍增在阳极上形成较强信号激发光阴极产生光电子发光样品产生光子光电倍增管高压高速放大器高速分频器高速比较器相对发光单位数字脉冲(RLU) 脉冲信号

单光子计数式发光检测仪 计数/贮存器单光子计数器打印机程控高压计算机样品运动/定位装置原位注射泵控制器程控自动门锁及检测装置发光仪执行模块发光仪控制模块

光生物学技术的应用范围 • 军事侦测 • 公安稽查 • 卫生检疫 • 药物筛查 • 医学诊断 • 环境检测 • 航天遥感 • 生命科学 • …… 已成为现代生物技术最活跃的领域之一

光生物学检测技术的优越性 • 彻底消除了放射性危害 • 无半衰期限制，试剂稳定性和有效期大大延长 • 容易实现连续、动态、重复测定 • 适合于复合标记系统进行多指标并行测定 • 操作简单，反应速度快，容易实现自动化 • 灵敏度和线性范围超过以往技术

几种标记/检测技术灵敏度的比较 灵敏度(mol/L) 10-18 10-15 10-12 10-9 酶标放免荧光发光

几种标记/检测技术线性范围的比较 线性范围 105 104 103 102 酶标放免荧光发光

几种标记/检测试剂的有效期比较 有效期（月） 18 15 12 9 6 3 0 酶标放免荧光发光

试剂盒 仪器 100,000 特殊防护治理污染 80,000 60,000 40,000 20,000 0 人民币人民币发光酶标放免三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用

免疫分析技术基本原理 利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法 • 抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。 • 抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的球蛋白。

免疫测定技术分类 反应结束后是否需要分离均相法（Homogeneous）非均相法（Heterogeneous）

均相法（Homogeneous） • 免疫凝集法：自然凝集：血型测定肥达氏反应；敏化凝集：血球凝集法凝胶（微粒）比浊法 • 免疫扩散法；免疫电泳法近场液闪法， • 酶--辅酶（亚基）配位法 • 荧光偏振法，荧光共振法 • 吖啶酯水解法，生物传感器

非均相法（Heterogeneous） • 免疫印迹（Western-blot）：基因表达分析、HIV感染确认实验 • 免疫组织化学技术：原位基因表达分析、临床病理学分析 • 纸片法：早孕快速检测、吸毒检测快速、献血快速检测 • 放射免疫法（RIA）：沉降法（放免）、固相法（免放，IRMA） • 荧光免疫法（FIA）；酶联免疫法（EIA，ELISA） • 酶联荧光法（FEIA）、化学发光法（LIA） • 酶联化学发光法（ELIA）、时间分辨荧光法（DELFIA）、电化学发光法（ECLIA）；……

双抗体夹心法（三明志法）原理 待测物标记抗体包被抗体固相支持物表面

夹心法的剂量--反应关系曲线 分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）： S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。功能灵敏度：测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度。线性范围：（分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度相关系数≥0.99的曲线范围信号强度（Y） Hook(前滞)效应待测物浓度（X）线性范围

竞争法的原理 待测物标记抗原包被抗体固相支持物表面

竞争法的剂量--反应关系曲线 分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）： S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值功能灵敏度：测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度线性范围：（分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度相关系数≥0.99的曲线范围信号强度（ Y ）待测物浓度（ X ）线性范围

间接法原理 标记抗体（二抗）待测抗体包被抗原包被体

俘获法原理 标记抗原待测抗体俘获抗体（二抗）包被体

双抗原夹心法原理 标记抗原待测抗体包被抗原包被体

间接包被夹心法原理 标记抗体待测抗原俘获抗体包被连接物包被体特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺

发光免疫分析基本操作步骤（一步法） 待测样品标记抗体或抗原包被抗体或抗原的反应管反应30-60分钟洗涤去除未结合的反应物反应0-5分钟发光底物仪器检测

发光免疫分析基本操作步骤（二步法） 待测样品包被抗体或抗原的反应管反应30-60分钟标记抗体或抗原洗涤去除未结合的反应物反应30-60分钟洗涤去除未结合的反应物反应0-5分钟发光底物仪器检测

发光免疫分析技术 的现状及应注意的问题

目前已商品化的光生物学标记检测技术整体性能比较目前已商品化的光生物学标记检测技术整体性能比较时间分辨荧光（也称时间延迟光致发光）：Time Resolved Fluorescence （Time Delayed Photoluminescence）解离增强荧光免疫分析（DEFIA）电化学发光（也称场致发光）：Electrochemiluminescence（Electroluminescence）化学发光：Chemiluminescence

这些发光检测技术的灵敏度及线性范围都已经接近了免疫反应的极限。这些发光检测技术的灵敏度及线性范围都已经接近了免疫反应的极限。片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强弱，不仅毫无意义，而且也是荒谬的。灵敏度的瓶颈在于抗体亲合力和干扰免疫反应的因素，而不是检测技术。筛选抗体、屏蔽干扰，生产工艺、管理水平和技术服务是试剂生产的关键例如：电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.005mIU/L 第四代化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.001mIU/L 原因在于抗体的亲合力，而不是检测技术。

发光技术—— 临床免疫分析划时代的进步普通放免功能灵敏度1-2mIU/L 基本无法测到正常值下限以下的血清TSH浓度对甲亢的诊断意义不大固相放免功能灵敏度 0.1-0.2mIU/L 在甲亢的诊断中开始发挥作用发光免疫功能灵敏度 0.01-0.02mIU/L 成为甲亢诊断的首选指标之一发光免疫功能灵敏度 0.001-0.002mIU/L 一系列新的临床现象改写了垂体甲状腺轴的调控状态第一代 TSH检测试剂盒第二代 TSH检测试剂盒第三代 TSH检测试剂盒第四代 TSH检测试剂盒以TSH(促甲状腺素)为例

目前商品化发光免疫分析产品的几个特点 • 大多采用全自动工作方式，部分采用微孔板半自动方式 • 多数采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面积，使灵敏度进一步提高，反应时间大大缩短 • 使用内建标准曲线加校正的办法产生工作曲线 • 部分产品采用流动池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光)

流动池检测方式示意图 冲洗液检测器干燥空气负压泵四通阀检测池废液计量泵氧化剂样品管原位进样泵

使用商品化发光免疫分析产品 可能遇到的几个问题 • 与以往方法（放免等）在检测指标的正常值及临床意义上的差异。如：免疫源性胰岛素与真胰岛素、HCG、性激素等 • 采用不同的单抗或多抗时检测结果也有较大差异。（单抗特异性好，受干扰小，因此测值低） • 不同厂家产品测定结果之间一致性差（未与国家标准品比对）。 • 所使用的内建标准曲线结合校正的方法不尽完善。 • 部分产品不显示原始数据，无法监控其准确性。

免疫分析结果的干扰因素 本底物质温度防腐剂金属离子杂质氧化剂光线还原剂磁场

同一干扰因素对不同检测方法的不同影响 免放或发光法洗涤祛除放免法信号↓ 结果↑ 信号↑ 结果↓ 离心沉降标记抗原待测物包被（结合）抗体 TBG 以甲状腺素结合蛋白（TBG）干扰竞争法测定T3为例

使用商品化发光免疫分析产品 必须做好的几个工作 • 在厂家提供的数据基础上，自行建立正常参考值系统。 • 明确各个试剂盒的特异性及交叉反应情况如：小分子激素之间，以及与自身前体或代谢物之间的交叉胰岛素与C-肽、胰岛素原之间的交叉 FSH、LH、HCG之间的交叉。 • 充分利用现有国标参考品校正结果（注意防腐剂干扰）（可以从国家药品生物制品检定所或临床检验中心得到） • 自行建立多点质控（2-3点）监控每次实验的准确性。尽可能避免干扰因素采样：清洁样品管（防止还原剂干扰）、不使用酶抑制剂、及时送检实验室：恒温、避免强光和强磁场、严格操作规程、及时维护、报修

正常值参考的意义及灰色区域的存在 如果测定结果处于灰色区域（约在正常值上下限以内20%）内，则需要进一步追踪检查。 95%或99% -20% +20%

自身基础数据 ——最佳“正常参考值” 对于患者来讲，最佳的参考值是自己以往的测定数据，即自身对照；因此积累病人的基础数据非常重要。尤其是性激素、生长激素、胰岛素等具有周期性分泌或释放规律的激素。 FSH 某一患者变化规律（无排卵峰）正常人平均值变化规律正常参考值范围时间卵泡期排卵期黄体期月经期

检验医师 必须牢记检验医师给临床所提供的一切服务仅限于 • 保证检验结果准确性的 • 对该检验项目或其检验结果普遍意义的解释建立和完善实验室面向临床大夫乃至患者的咨询制度不要试图替临床大夫为某一具体病例作出最终诊断

化验结果与临床不符的原因 原因解决操作失误、仪器故障、试剂失活等因素排除这些因素后重复测定或重复送样某些夹心一步法试剂往往存在前滞效应用同试剂盒的校准品A 稀释后再重新测定药物以及其它基础疾病的干扰及时与临床沟通结合说明书综合判断由于个体差异或不明干扰因素的存在，总有少数病例的化验结果与其临床表现不符

不同实验方法， 或同一方法的不同厂家产品之间，其测定结果和临床正常值都会有所差异在厂家提供的正常参考值基础上建立自己的正常参考系统不同实验室环境和不同人群条件下，其测定结果和临床正常值也会有所不同及时采样、送检，实验室及时完成化验，严格按照试剂盒说明书要求存放待测物质的降解及其与血清蛋白结合状态的改变，某些化验项目的检测结果往往受标本存放时间及其贮存条件的影响

常见临床免疫检测指标的意义 及其限制因素

下丘脑-垂体-内分泌轴及其调节关系 激素类型氨基酸：甲状腺激素蛋白（肽）：甲状旁腺激素、下丘脑激素、垂体激素、降钙素、胎盘激素、心肌激素、胃肠激素类固醇：性激素和皮质激素儿茶酚胺：肾上腺素长反馈：垂体或下丘脑激素受靶细胞分泌激素的反馈调节，以负反馈为主，但排卵时雌激素为正反馈。短反馈：垂体激素对于下丘脑的反馈负反馈超短反馈：下丘或垂体激素直接负反馈自身的合成和分泌

类固醇激素的合成 男女性激素和皮质激素均来源于共同的前体和合成、代谢途径，其结构也非常相似。因此皮质功能紊乱、肝肾功能紊乱、某些遗传缺陷、服用类固醇药物等均可造成这些激素测定结果的异常。

甲状腺功能指标评价 甲亢的诊断价值依次为：TSH=FT3＞FT4＞TT3＞TT4 甲低的诊断价值依次为：FT4=TSH＞TT4＞FT3＞TT3 TGAb TMAb =TPO抗体发光法TSH、FT3 、 FT4提高了灵敏度，使得其临床意义大于TT4和TT3 第一代第二代第三代两步法操作时间长灵敏度差准确性差类似物法操作时间短灵敏度较好准确性较好反向竞争法（标记抗体）操作时间短灵敏度更好准确性更好血清FT3 、 FT4试剂盒的发展（消除结合蛋白对测定的影响）

生长激素（GH） • 其生理作用需要通过生长介素(SM)介导 • SM也称胰岛素样生长因子(IGF)，主要在肝脏及多种GH靶细胞合成 • SM-C即IGF I，结构与胰岛素有近一半的氨基酸残基相同。 GH测定的临床意义运动刺激试验药物刺激试验（胰岛素-低血糖试验） GH分泌的抑制试验 • 生长激素紊乱生长激素缺乏症（侏儒）巨人症及肢端肥大症 • 垂体腺瘤、肾癌、肺癌

发光免疫检测技术的临床应用 及其应注意的问题