Jana Petković 17.11.2006

1. Opazovanje sestavnih delov fotosintetskih membran bakterij in njihove organizacije in situ z mikroskopom na atomsko silo (AFM) Jana Petković 17.11.2006

2. ¼ genoma evkariontov in prokariontov vsebuje zapise za membranske proteine • razumevanje membranskih fenomenov zelo omejeno zaradi pomanjkanja strukturnih informacij • poznamo zelo malo struktur membranskih proteinov (rendgensko žarčenje in elektronska kristalografija) • AFM se je razvila v močno orodje raziskovanja membranskih proteinov • vzorce lahko opazujemo v nativni obliki • v različnih okoljih • brez predhodnega označevanja • odlična ujemanja topografov AFM proteinskih struktur v primerjavi z elektronsko mikroskopijo in kristalografijo z X-žarki • možnost nanodisekcije bioloških vzorcev

3. vzorec skeniramo s tipalom, ki je pritrjeno na ročico sila med vzorcem in tipalom povzroči deformacijo ročice in se le-ta upogne upogib ročice najpogosteje merimo z laserskim žarkom, s katerim svetimo na zgornjo površino ročice, od koder se odbije v fotodetektor signal iz fotodetektorja sporoči kontrolni enoti za kakšno vrsto upogiba gre procesna enota (računalnik) iz velikosti premika sestavi sliko na računalniku

4. ročica s piramidalno oblikovano konico (tipalo), ki je v stiku z vzorcem optično gibalo, sestavljeno iz laserja in fotodetektorja, ki omogoča zaznavanje upogiba ročice piezoelektrični skener, ki usmerja vzorec glede na tipalo v smereh x, y in z računalnik, ki poganja mikroskop in shranjuje površinske konture AFM - instrumentacija

6. Več načinov dela: • kontaktni način: tipalo in vzorec se stikata • merjenje pri konstantni sili (vzorec premikamo v vertikalni smeri, tako da je odmik ročice iz ravnovesne lege vedno enak) • merjenje pri konstantni višini (vzorec fiksiramo v vertikalni smeri in merimo spreminjanje sile, torej različne odmike ročice od ravnovesne lege) • nekontaktni način: tipalo niha nad površino vzorca • tipalo ne pride v stik z vzorcem in se ne kontaminira • možno je snemanje zelo občutljivih vzorcev • oscilirajoči način(“potrkavanje”) • ročica niha z resonančno frekvenco z razmeroma veliko amplitudo in se pri vsakem nihanju le dotakne vzorca, manj poškodujemo vzorec in se izognemo trenju, adheziji in elektrostatičnim silam (prednost pri gledanju mehkih bioloških vzorcev)

7. Interakcije substrat-vzorec in vzorec-tipalo • delo v kontaktnem načinu povzroča trenje • lahko zmanjšamo sile trenj z oscilirajočim načinom, ki dopušča opazovanje rahlo adsorbiranih vzorcev, čeprav z zmanjšano ločljivostjo • adsorpcija vzorca je odvisna od narave in koncentracije elektrolitov v puferski raztopini • za slikanje elektrolite moramo izbrati tako, da se ustvari ravnotežje med elektrostatsko odbojno in Van der waalsovo privlačno silo

8. Slikanje-ključni parametri • trdnost adsorpcije objekta (membrane, ki niso zadosti trdno adsorbirane-meglena slika) • fizične lastnosti mehanizmov, ki delujejo na površino membran (npr mobilnost struktur, ki predirajo membrano) • geometrija tipala: asimetrično oz dvojno tipalo (geometrija tipala se oddaljuje od hemisferne oblike)- ovira zanesljivost določanja kontur • radij tipala- vpliv na lateralno ločljivost, kar pride do izraza predvsem v kontaktnem načinu opazovanja • trdnost in mobilnost vzorca • biološki vzorci so mehki in mobilni- moramo vdrževati nizke vrednosti sil, uporabljenih za tipalo, da ne pride do morebitne deformacije vzorca • topografe moramo posneti v kratkem času, da preprečimo zamegljenost slike zaradi premikanja vzorca Ločljivost: • dosežemo atomsko ločljivost na trdnih kristalnih strukturah kot so sljuda ali grafit (te uporabimo za imobilizacijo) • pri lipidnem dvosloju, ki vsebuje membranske proteine, je ločljivost v puferski raztopini omejena zaradi gibljivosti proteinov na sobni temperaturi (lateralna ločljivost <1 nm, vertikalna ločljivost 0,1 nm )

9. Fotosintetski aparat škrlatnih bakterij • za absorpcijo svetlobe in njeno pretvorbo v kemijsko energijo so potrebni 4 transmembranski kompleksi pigmentov, lokalizirani v intracitoplazemskih membranah: • periferni kompleks, ki zbira svetlobo LH2 • centralni kompleks, ki zbira svetlobo LH1 • fotokemijski reakcijski center RC • citokromski kompleks cyt bc1 za translokacijo protonov

10. Reakcijski center: Heterotrimer, vsebuje proteinske podenote L, M in H. • LH antene: Heterodimer sestavljen iz 2 majhnih polipeptidov α in β, oba predirata membrano enkrat kot transmembranski heliks. Z njihovo agregacijo v obroč dobimo tercijarno strukturo kompleksa, ki izgleda kot votel cililnder. • LH1-RC centralni kompleks: Ni znana struktura na atomskem nivoju. • Cytbc1: Razvozlane so strukture homologov iz mitohondrij in cianobakterij, je dimer pravokoten na mebransko ravnino.

11. Priprava intracitoplazemske bakterijske membrane (ITC) bakterijske celice razbijemo z večkratno pasažo s francosko prešo lizat damo na saharozni gradient in centrifugiramo pred analizo z AFM dializiramo lizate v pufru brez saharoze če so prečiščene ITC premajhne, induciramo fuzijo membran s cikli zmrzovanja in odtajevanja.

12. Slike (AFM) Rhodospirillum rubrum – LH1-RC Rubrivivax gelatinosus – LH2

13. PSU- photosynthetic unit (AFM) Blastochloris viridis Rhodospirillum photometricum Rhodobacter blasticus

14. Trenutni pogledi… • gosto pakiranje PSU predstavlja problem za vse procese v membrani, za katere potrebujemo prosto difuzijo skozi membrano (prenos kinon-kinol med RC in cyt c1) • kako je možno vzpostaviti stike protein–protein, za katere je potrebna funkcionalnost PSU v membrani in hkrati omogočiti učinkovito difuzijo Q/QH2 v membrani? • rezultat dobljen z AFM: odsotnsot cyt bc1kompleksa v membrani nekaterih bakterij (Blastochloris viridis), zanalizo SDS-PAGE pa je prisotnost bila potrjena možna razlaga: • v celicah je cyt bc1 lociran blizu membrane ali na koncih intracitoplazemskih invaginacij, ploska struktura teh invaginacij slikanih z AFM vsebuje veliko proteinov PSU, cyt bc1 pa zelo malo ali nič • PSU membran se pri AFM adsorbirajo preferenčno na podporo

15. Zaključki • Lahko preučujemo molekularno organizacijo fotosintetskih kompleksov pri visoki ločljivosti v nativnih membranah brez predhodnega topljenja, čiščenja ali kristalizacije. • Lahko spremljamo konformacijske spremembe bioloških struktur. • Škrlatne fotosintetske bakterije predstavljajo edinstven sistem za zbiranje in povezovanje strukturnih ter funkcijskih informacij. • Podatki kažejo, da bo AFM postala ključna tehnika za raziskovanje fotosintetskih aparatur v nativnih membranah (od bakterij do rastlin).

16. Literatura • Scheuring S., Lévy D., Rigaud J-L. 2005. Watching the components of photosynthetic bacterial membranes and their in situ organisation by atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes, 1712: 109-127 • Engel A., Lyubchenko Y., Müller D. 1999. Atomic force microscopy: a powerful tool to observe biomolecules at work. Trends in cell biology, 9: 77-80 • Müller D., Anderson K. 2002. Biomolecular imaging using atomic force microscope. Trends in biotechnology, 20: S45-S49