IMMOBILIZ Á L Á S

1. IMMOBILIZÁLÁS Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek felületi rögzítése hordozón polimerekbe zárása keresztkötése

2. Immobilizáció • a sejtek kötődésének vagy bezárásának különböző formáit összefoglaló fogalom • A természetben gyakran találkozunk vele - legtöbb sejt életciklusa bizonyos fázisában igyekszik helyhez kötődni • Élő sejtek polimer gélbe zárását először 1969-ben Updike és mtsai írták le • Tudományos és ipari jelentőség: pl. aminosavak, szerves savak, antibiotikumok, szteroidok, enzimek előállítása • Környezeti alkalmazásuk is egyre jobban terjed

3. Előnyök • Védjük a rögzített sejteket a külső behatásoktól, valamint megakadályozzuk eltávozásukat a reakciótérből • Állati és növényi sejteket, szöveteket is lehet immobilizálni • Számos biokatalitikus rendszer számára előnyös • Javul a metabolikus aktivitása a sejteknek • Plazmid stabilitás nő • Kisebb a fertőzés veszélye • könnyebben tárolható • Hátrányok • A szaporodó sejtek kiszabadulhatnak az immobilizáló anyagból, ha szétfeszítik azt • A diffúziós barrier a mátrix, vagy a nagy sejtsűrűség miatt növekedhet • Aerob rdsz-knél az oxigénhez gátolt lehet a hozzáférés

4. Milyen paramétereknek kell megfelelnie egy jóhordozónak: • Nem-toxikus • Nem szennyező • Jó minőségű, hosszú élettartam • Biztosított legyen a sejtaktivitás és denzitás • Biztosított legyen a sejtek kijutása a célhelyre (ha szükséges) Hordozók • Természetes és szintetikus polimerek: agar, agaróz, poliakrilamid alginát, karragenan, polisztiréncellulóz, kollagén, stb poliuretán • Egyéb: üveg, kerámia, agyag, apatit, alginit, ioncserélő gyanták

5. 1. 2. a, b, 3. 4., 5. 6. • Immobilizálási stratégiák • felületi adszorpció • bezárás a:encapsulationb: entrapment • keresztkötés • biofilm képzés • aggregátum képzés, flokkuláció • hordozóhoz kötés (ionos, kovalens)

6. A sejtek a szilárd felszínhez egy/több fehérjén keresztül kapcsolódnak Lpp = lipoprotein OmpA = outer membrane protein A AmCyan = cyan-fluorescent protein

7. M frakciót jelképezi Keresztkötött G frakciót jelöli Gélesedési zóna Alginát • Barna algából nyerik • Lineáris poliszaharid, b-D-mannuronát (M) és a-L-guluronát (G), 1 4 kötések • Homopolimer blokkok (G-, M-blokk) ill és vegyes blokkok (GM blokk) random szerveződnek (az alginát eredetétől függően egyedi szerkezet/felépítés) • G-blokk divalens kationokkal (Ca2+, Ba2+, stb) stabil keresztkötéseket hoz létre, ennek köszönhető, hogy immobilizáláshoz használni tudjuk • Több G-blokk esetén erősebb, rigidebb gélt kapunk és kisebb porusméreteket, több M-blokk esetén lágyabb a gél és nagyobb porusméreteket találunk • A gélesedés nem hőmérséklet függő

8. sejtszuszpenzió Alginát oldat Metabolitok, anyagcsere termékek sejtek Alginát burok tápanyagok Idegen mikróbák CaCl2 oldat Alginát gélágy kialakítása Egyszerű, sejt- és környezetbarát módszer

9. karrageenan • Vörös algák termelik • 3 típus: i-, l-, k-karrageenan • Nagyon sokféle forma, de az alapváz közös: b(1,3)-D-galaktóz és a(1,4)-D-galaktóz molekulák váltják egymást, viszont eltérnek abban, hogy a két cukor hol szulfonált és mennyi szulfoncsoportot tartalmaz • A gélesedés hőmérséklet függő folyamat, K+ ionok jelenlétében • Hátránya, hogy a gélesedéshez legalább 40°C szükséges, mely az immobilizálandó mikrobák többségének kedvezőtlen melegítés hűtés

10. Gelrite • Természetes anionos poliszaharid, glükuronsav, rhamnóz és glükóz alegységekből épül fel • rigid, agarszerű gélt képez elsősorban kétértékű kationok jelenlétében • hőstabil

11. Kitozán • Kationos polimer, D-glükóz-amin egységekből épül fel • Legtöbb savban, főleg szerves savakban oldható • Nem toxikus, lebontható • Kozmetikai, orvosi, élelmiszeripari jelentősége is van

12. ciklodextrin • A ciklodextrin keményítőből előállítható, belül üreges, henger alakú molekula, amelybe, mint egy kapszulába, bezárhatók más anyagok molekulái. • A keményítőben a kötéseket a térállású OH-csoportok hozzák létre, minden kötés ugyanolyan irányba fordul, ezért a keményítő molekulája úgy csavarodik, mint egy spirálrugó, vagyis hélixszerkezetű. • A Bacillus macerans (és néhány egyéb mikro-organizmus) által termelt enzim ezt a hélix szer-kezetet úgy hasítja el egyszerre két helyen, hogy egyúttal össze is zárja a keletkező két szabad vég-csoportot, s így alakul ki a ciklodextrin-szerkezet. • E molekuláris „csomagolóanyag” lehetővé teszi, hogy új, a meglevőknél hatékonyabb gyógyszereket gyártsunk. • környezeti alkalmazhatósága is bizonyított, mivel immobilizálja a szennyeződéseket, vagy akár a remediációhoz használandó mikrobákat alfa-ciklodextrin(a hidrogénatomokat zöld, az oxigént piros, a szenet szürke színű gömbök jelölik)

13. Poliakrilamid • Az akrilamid gyökképző (ammónium perszulfát) hatására lineáris polimert képez, s ezt a polimerizációs folyamatot katalizátorral (TEMED) lehet gyorsítani. A térhálós polimer szerkezet kialakítása bis-akrilamid alkalmazásával oldható meg. Ilyen térhálós szerkezet nemcsak makromolekulák, fehérjék, nukleinsavak elválasztását, de immobilizálását is lehetővé teszi. kaolin agyag polyacrylamide ‘híddal’ metastabil szerkezetet hoz létre(SEM image)

14. Polisztirol • Polisztirollal mindenhol találkozunk környezetünkben • A polisztirol a sztirol polimerizációs terméke, policiklusos aromás szénhidrogén. • a sztirol a kőolaj feldolgozás egyik mellék-terméke, normál hőmérsékleten meg-lehetősen állandó (az Egészségügyi Világ-szervezet (WHO) szabványa szerint azonban mérgező, és rákkeltőként is figyelembe kell venni). Könnyenpolimerizálódik • A polisztirol ellenáll a savaknak, lúgoknak, de a legtöbb szerves oldószer megtámadja, és érzékeny a fényre is. • Az 1930-as évektől használják intenzíven, először szintetikus gumit állítottak elő belőle

15. Poliuretán • A poliuretán (PUR) csaknem korlátlan lehetőségekkel bíró termoplasztikus műanyag. Régóta alkotóeleme mindennapi életünknek. Két, speciális receptúra szerint előállított komponensből (A - poliol, B - izocianát) áll, melyből az adalékok mennyisége és minősége, valamint a komponensek keverési aránya alapján kemény, félkemény és lágy habanyagok, öntőmasszák, lágy vagy kemény elasztomerek gyárthatók a legkülönbözőbb felhasználási célokra. A B

16. Bioremediációs alkalmazások • Fontos szempontok: produktivitás stabilitás az alkalmazás során stabilitás a tárolás során érzékenység a szennyezőanyagokra egyszerű/összetett biztonság előnyök/hátrányok • Szennyvíz tisztítás, talaj remediáció, biofilm, bioreaktorok,

17. pumpa bioreaktor gyűjtőtartály UV/VIS szubsztrát detektor Biodegradáció immobilizált sejtekkel és enzimekkelpéldák • Szerves-foszfát peszticidek bontása:Pseudomonas diminuta - foszfotriészteráz enzim széles szubsztrát specifitásparaoxon hidrolizis:immobilizálás: (porózus szilikagélre), tritil agaróz egyszerű eljárás fix-ágyas csőreaktor

18. Szennyvíz tározótó bioreaktor H2SO4 Tápanyag tank levegő Kiegyenlítő tank • Herbicidek bontására példa: glifozát széles spektrumú herbicid, előszeretettel alkalmazzák (Monsanto szennyvízkezelés szükségessé vált)pilot plant: kovaföldre immobilizált mikroba konzorcium

19. levegő gélmembrán elhasznált levegő A kapszula belsejében Az adszorbens és a sejtek CO2 csapda • Fenolos hulladékok bontásaFusarium flocciferum poliuretán + felületaktív anyag 1 g/L fenol koncentráció mellett négy hónap alatt teljesen elbontja • Pentaklórfenol bontásaArthrobacter sp. koimmobilizált rendszer: a baktériumot aktív szénre rögzíti, majd alginát oldatba adagolja (egyéb hordozókat is vizsgáltak) Fontos paraméterek: az adszorbens mennyisége, az alginát gél porozitása, segíti a PCP adszorbciót és mineralizációt felületaktív anyag jelenléte

20. PCP bontása Arthrobacter-rel

21. 3 1 4 2 6 2 4 2 1 1 3 3 5 4 • 5 mg/L CP – free c. • 10 mg/L CP – free c. • 50 mg/L CP – free c. • 5 mg/L CP – imm. c. • 10 mg/L CP – imm. c. • 50 mg/L CP – imm. c. • 10 mg/L CP – free c. • 50 mg/L CP – free c. • 10 mg/L CP – imm. c. • 50 mg/L CP – imm. c. • 5 mg/L CP – free c. • 50 mg/L CP – free c. • 5 mg/L CP – imm. c. • 50 mg/L CP – imm. c. Alginát gélbe zárt, CP bontásban élenjáró baktériumok összehasonlítása baktériumok: Pseudomonas putida, Pseudomonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter

22. Fenol bontás kevert kultúrávalüveglapra kolloid szilika oldatba kevert mikroorganizmusok rögzítése, a rögzült rétegre újabb szilika réteget visznek.

23. p-nitrofenol (PNP) bontásapeszticid és gyógyszergyártásban fordul előPseudomonas sp. 8 törzs együttesen (P. putida, P. fluorescens, P. mendonica)Kovaföld hordozó, oszlop bioreaktor, levegőztetetta rögzített sejtek képesek tolerálni az 1800 mg/L PNP konc. is! • Poliklórozott bifenilek bontásakét Pseudomonas faj és egy Alcaligenes faj ko-kultúrában bont kevert PCB-t, három féle hordozón

25. Morfolin bontás Mycobacterium aurum-mal (G+ baktérium)morfolin = 1,4 – tetrahidro – oxazin (heterociklusos vegyület: C4H9NO)származékai: adalékanyagok, oldószerek,antioxidáns anyagok, stb.gyártásuk során az effluensben morfolinjelenik meg, ezért fontos lebontásánakkidolgozása

26. Nikkel - ötvözet szálakon létrehozott Thiobacillus ferrooxidans biofilm vas-szulfát oxidációja- acidofil, aerob kemolitotróf baktérium- extrém alacsony pH (< 2,0) a vas(III)szulfát kicsapódásának elkerülése érdekében- a baktérium igyekszik hozzátapadni szilárd felszínhez, így nem könnyen mosódik ki

27. Higany biotranszformáció fluid-ágyas bioreaktorban- különösen a szerves higany vegyületek veszélyesek, bár ipari és mezőgazdasági felhasználása ma már korlátozott, de tartósan ott maradt a környezetben, - ivóvízben < 1μg/L a max. megengedett konc. - mikrobiálisan az oxidációs állapot változtatható, illetve a szerves higany vegyületek átalakíthatók (az elemi higany kevésbé toxikus)- pl. Aeromonas hydrophilia – kofaktor függő higany reduktáz rendszere - szilika és aluminium porózus hordozóra rögzítve, de több probléma is volt, pl. az elemi higany akkumulálódott, nem távozott el. Levegőztetéssel némileg javult, és a gőztérből kihajtották a Hg-t, melyet kondenzáltak, majd reciklizálták- a problémák kiküszöbölésére új rendszer - Pseudomonas putida KT2442, random mutagenezissel létrehoztak egy Hg(II) redukáló törzset (első próba polivinil alkohol hidrogélbe) - alginát gélbe ágyazott sejtekkel igen jó eredmények folyamatos rendszerben

28. Kadmium eltávolítása bioszorbens segítségével- abból indultak ki, hogy a poliszaharidok kötődnek fémekhez ezt a tulajdonságot fordították meg, kadmiumot a cukor polimerhez alginát, mint szorbens megfelelő volt air-lift reaktorban kivitelezve- a telítődött szorbensből megfelelő eljárással kivonható a kadmium

29. Flow rate: 2 dm3/min Flow rate: 4 dm3/min Kevesebb belépőkadmium esetén a szorpció hatékonyabb Emelt szorbens koncentrációmellett szintén kevesebbaz effluens kadmium tartalma A szorbens porozitásaszintén befolyásoljaa kötődés hatékonyságát

30. Felületaktív anyag bontása alginát/pektát gélbe immobilizilált Comamonas terrigena baktériummal- vegyipar, gyógyszeripar, élelmiszeripar használja- negatívan hat a mikrobiális életre, mivel megbontja a membrán stabilitását, habzik befolyásolva az oxigén diffúziót (bizonyos esetekben előnyös a jelenlétük olajbontás)- gélágyba immobilizálva a sejteket megvédjük a káros hatásoktól konkrét példa: anion aktív anyag – dihexilszulfoszukcinát (DHSS) alginát/pektát kevert gélágyban Comamonas terrigena