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应用 PCR 技术检测空气传播疾病. 乔杰 10808041. 目录. 背景 相关知识介绍 技术拓展 文献图例 举例：马铃薯晚疫病 讨论. 背景.
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应用PCR技术检测空气传播疾病 乔杰 10808041
目录 • 背景 • 相关知识介绍 • 技术拓展 • 文献图例 • 举例：马铃薯晚疫病 • 讨论
背景 • 在1845年多雨的夏季里，爱尔兰的马铃薯染上了枯萎病。这种病会使马铃薯腐烂，不能食用。感染枯萎病的种子在第二年再使用时，枯萎病的病况会变得更为严重。 1848年和1849年，枯萎病再度发生。爱尔兰人走投无路，他们一个个饥饿而死，对疾病毫无抵抗力。当时，爱尔兰是联合王国的一部分，但是英国政府很少给予它什么帮助。大约有100万爱尔兰人不是饿死，便是病死。还有100万人逃到英格兰、北美或澳大拉西亚（一般指澳大利亚、新西兰及附近南太平洋诸岛）。这200万人占1845年爱尔兰人口的四分之一。 • 人们通常认为，引起这场饥荒的晚疫病菌是一个名为US-1的菌株，来自墨西哥。 • 晚疫病最先发现于墨西哥的野生马铃薯，在十九世纪，随着美国农业的发展，这种疾病一路向北传播。1845年，晚疫病通过美国的马铃薯出口业务踏入了比利时。 • 而致使马铃薯大面积绝收的直接原因是来自南美洲的一种通过孢子传播的真菌。 得出这一结论的是美国北卡罗莱纳大学植物病理学部让·比格尔·里斯泰诺领导的一个研究小组。这是一个专门检测DNA的研究小组，他们经过检测大饥荒时期留下的马铃薯叶子的遗传物质图谱，才发现了这一与以往不同的结论。
背景 • 病原体在长期演化过程中不但适应在机体的一定部位发育、繁殖，并且也适应在宿主机体外的自然条件下暂时存活，而后再侵入一个新宿主，循此世代绵延，以维持病原体作为一个生物物种的存在。此种更换宿主的过程，在流行病学中称为传播机制（mechanism of transmission）。各种传染病的传播机制可概括为三个阶段：①病原体自宿主机体排出；②病原体停留在外界环境中；③病原体侵入新的易感宿主体内。 • 病原体更换宿主在外界环境下所经历的途径，称为传播途径（route of transmission ，mode of transmission，mode of spread）。具体说，传播途径是指病原体内传染源排出，侵入另一易感机体所经过的途径。
相关知识介绍 • 生物气胶（Bioaerosols）通常定义为由微生物、植物和动物所产生的气溶胶或粒子。生物气胶可由致病性或非致病性的、活的或死的细菌、真菌、病毒、高分子量抗原、细菌内毒素、霉菌毒素、肽聚糖、葡聚糖、花粉与植物纤维等所组成。自然界中存在着不同的生物气胶，人体更可能于生活、工作环境中吸入生物气胶而致病。环境中生物气胶的暴露与人体健康之间有很大的关联，于公共卫生方面的冲击主要有传染病、急性中毒影响、过敏症与癌症等疾病。其中，生物气胶对于人体呼吸道和肺功能健康的损害，更可能是损害人体健康最重要的影响因素之一。 • 湿度为微生物生长最重要的外在条件之一，此乃基于生物特性使然，业已有许多研究结果可加以证实，以真菌孢子为例，其细胞最外层存在有一层疏水性细胞壁，主要用以抵抗孢子在传送中的环境压力，当抵达适当的地点(高湿度)时，便开始繁衍生殖。 • 温度、气象及季节对微生物生长的影响。温度为微生物生长的重要限制因子，一般的微生物属于适中温性(15~35℃)；气象条件如风速、日照及降雨等因素，季节变迁意味着温度、大气环境条件也跟着改变，此均会对生物气胶产生影响。
七天孢子容量测定收集器 • 该产品占地小，带有内置泵，用于采集空气传播颗粒，如菌类孢子和花粉。它可以连续七天无人值守。标准口径为2x14毫米。此外还有口径为½x14毫米的收集器可供选择。电压：230-250伏，50赫兹；110-115 伏，60赫兹；12 伏直流电。 • 在粒子的收集和沉降过程中，微生物会由于机械压力和脱水而失去发育能力。测量得到的微生物浓度很大程度上依赖于采样技术和分析方法。生物采样器主要依据撞击、碰撞、过滤等机理采样，因此可用不同的物理采集效率表征。
Burkard多级液体集尘器 高精度 May标准液体集尘器，可以重复性、高效持续性地收集颗粒， 并将它们进一步分离成一定大小的微粒。该设计不仅坚固耐用而且易于清洗和消毒。由于小颗粒被收集到液体中，样品不易超量，而且不同的样品培养方式还可以用来对所收集的物质进行评估。 Burkard室外用气旋采样器 一个使用风力定向、风力为16.5 升/分钟的不间断容积测定采样器， 其风力定向采用 单向逆流微气旋。该器械可在1 µm范围内提供高效采样。颗粒可被直接收集到1.5 ml 的塑料管(eppendorf vial) 内，在那里对它们通过免疫学或者显微技术进行传导或者分析 。
非常轻便的测定体积的空气质量监控器，多用于在培养室层流箱和家庭环境内进行细菌和其它颗粒的收集。它通过100孔(直径1毫米)的筛盘将被收集物直接收集到90毫米有盖培养皿内的培养介质上。它使用的标准Burkard涡轮能够提供每分钟10或20升的空气，工作时几乎没有噪音，该涡轮由6伏可充电电池供电，可连续供电3-4小时(使用市电电源的型号为110伏或者240 伏)。在采样匣下安装了一个可调整的空气控制器，以保证在采样过程中快速关闭。在该设备的基部有一个“开-闭”开关和间隔计时器以保证将运行时间调整在1-9分钟时间 内。如果调时器设在“0”的位置上 ，则涡轮可以不间歇地运转。 Burkard便携式琼脂盘空气采样器 Burkard可持续运作的空气记录采样器 一个用于连续24小时以上不间断操作的个人用空气采集器。由安装在器械上部的压缩孔将空气垂直抽取出来，将颗粒从气流中分离。对空气动力学直径大于等于5µm的颗粒，其分离率高于90%。位于孔下的载玻片进行不间断的移动，其移动方式可以预调，24小时以上可预置为2毫米/小时 – 12小时以上为4毫米/小时 –6小时以上为 8毫米/小时 。载玻片的全部移动距离为48毫米。
技术拓展: 从DNA水平鉴定空气中的悬浮颗粒方法 • PCR • 荧光定量PCR • RT-PCR • T-RFLP • DGGE • 微阵列 • 测序 • 焦磷酸测序
T-RFLP末端限制性酶切片段长度多样性 • T-RFLP末端限制性酶切片段长度多样性，又可以称为16sRNA基因的末端限制性片段分析技术。是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，日亦受到研究人员的重视。该技术已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征等多方面。T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5’末端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。提取待分析样中的DNA，以它为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物有合适的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况。这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大。
DNA 微阵列 • DNA 微阵列的原理:来自细胞、 组织和其他来源的生物样品的 mRNA 经反转录后得到荧光染料标记的cDNA ,然后与含有成千上万个基因的玻璃芯片进行杂交。荧光标记的 cDNA 与芯片上相匹配的DNA 序列发生杂交反应 ,使得芯片上的点呈现出荧光信号 ,荧光信号的强度与基因表达的丰度成正相关 ,根据信号强度可了解样本中各种基因存在或者基因表达的情况。
变性梯度凝胶电泳（DGGE） • 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。 • 为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵 。
DGGE是检测基因突变比较精确的方法，它不仅可检测单一片段的单点突变，对多点突变的检测亦较容易，该方法与PCR技术相结合，使其能非常快速的对大量标本进行分析。DGGE是检测基因突变比较精确的方法，它不仅可检测单一片段的单点突变，对多点突变的检测亦较容易，该方法与PCR技术相结合，使其能非常快速的对大量标本进行分析。 • 对于一DNA片段来说，其Tm值与基碱基组或有关，当其碱基组成发生变化时，Tm 值亦改变，因此，对于突变的片段来说，若其在一变性物质线性梯度增加的凝胶上进行电泳时，随着变性剂浓度的增加，当这种浓度达一定值时突变的DNA片段发生解链而形成分叉，其电泳迁移速度变慢。因此突变的DNA片段与正常的DNA片段电泳的迁移位置有差别，研究证明DGGE可检出任何类型的单碱基取代，如果将突变型与正常的DNA片段形成异源双链时，其敏感性大大提高。
DNA测序 • 一、经典的DNA测序技术 • 1977年Sanger建立的“DNA双脱氧链末端终止测序法”、Maxam和Gilbert建立的“DNA化学降解测序法” 是最初建立的DNA测序技术。目前，最主要的测序技术大都是以Sanger法为基础的。虽然两种技术的原理上有很大的差别，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一特定的碱基处终止，从而产生A，T，G，C四组不同长度的一系列核苷酸，再在PAGE胶上电泳进行检测，获得DNA序列。
二、发展中的DNA测序技术 • (一)自动测序仪 • 自动测序仪是80年代中期，应用双脱氧终止法的原理，用非放射性荧光标记代替同位素标记，在电泳过程中通过激光激发荧光，然后用探测器收集荧光信号，再通过计算机进行图像识别与分析的测序方法。这种方法实现了DNA测序的全自动化，并大大节约了人力与物力。 • (二)毛细管凝胶电泳测序技术 • 1990年Zagursky和Mccornick建立了毛细管凝胶电泳测序技术质谱测序技术。毛细管凝胶电泳技术将凝胶电泳对大分子的高分离率与cap电泳的快速、微量相结合。电泳中凝胶的抗对流性大大提高了分辨率。 • (三)杂交测序技术 • 杂交测序是根据DNA分子中碱基互补配对的特性，通过标记的单链DNA模板，与一系列短链寡核苷酸探针分子杂交，来实现DNA测序的策略。杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本。 • (四)基因芯片测序技术 • 早在1980年，Bains等人就采用将探针固定于载体上再利用杂交的方法进行DNA测序，这就是基因芯片测序技术的最初模型。基因芯片测序技术是建立在杂交测序基础之上的一种DNA测序方法。
(五)PCR直接测序技术 • PCR直接测序技术是以PCR扩增引物作为测序引物，这极大的提高了DNA测序分析的效率。 • (六)cDNA微阵列技术 • cDNA微阵列技术是以荧光标记的DNA探针，与cDNA微阵列进行杂交，从而进行扩大规模基因表达分析的一种新方法。 • 三、国际最新DNA测序技术SoIexa高通量测序技术 • (一)SoIexa高通量测序技术简介 • SoIexa高通量测序技术是由英国剑桥大学派生的SoIexa公司建立起来的。该方法以单分子阵列技术为基础，是对合成测序技术的发展与延伸。
(二)Solexa高通量测序技术具体流程(如图下图所示)：(二)Solexa高通量测序技术具体流程(如图下图所示)： • (1)准备基因组DNA样品：将DNA片段打断成几百个碱基，甚至更小的片段，随机的在小片段的两个末段加上接头； • (2)固定DNA：将单链DNA片段随机的与细胞内可流动的细胞内侧表面相粘连，使之固定； • (3)架桥：添加未标记的碱基和酶，来启动固体片段架桥； • (4)DNA片段复制：引物扩增单链DNA使之形成双链； • (5)双链DNA变性：双链DNA变性后，成为单链，并使其一端固定在酶作用底物上； • (6)完成扩增：大量的密度可达几十亿的双链DNA簇产生在可流动的细胞通道内； • (7)决定第一个底物：起始第一轮序列扩增，添加四个已标记的、可逆的终止末端序列、引物和DNA聚合酶到细胞可流动的管道内； • (8)显示第一个底物：激光刺激后，捕获DNA簇中可发荧光的影象，并记录第一个底物的特性。 • (9)通过大量的化学循环读出序列：重复上述测序循环，读出给定的底物序列。 • (10)排列数据：排列数据，对比参考资料，鉴别序列之间的区别。
Pyrosequencing技术 • Pyrosequencing技术的原理 • 焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。
其基本原理如下： 第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。 • 第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。 • 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。 • 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。 • 第5步：加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 • Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。
本文涉及到的内容 • 检测空气传染疾病的重要性 • 检测农作物疾病的方法 • PCR技术检测生物气溶胶 • 应用分子诊断方法预测疾病：机遇与挑战
喷洒杀菌剂的影响 QoIs类杀菌剂是一类作用于病原菌线粒体中电子传递链上cyt-bc1酶复合物Qo中心的一类药剂， 这类杀菌剂的作用靶标cyt-bc1是由线粒体DNA编码的，而不是由核DNA编码的。
马铃薯晚疫病（Potato Late Blight) 马铃薯晚疫病又称疫病、马铃薯瘟，是一种导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的毁灭性病害。 在多雨、冷凉、适于晚疫病流行的地区和年份，植株提前枯死，损失20%-40%。 曾引起爱尔兰饥饿，导致约100万人死亡。
1.症状 主要侵害叶、茎和薯块。最早发生在下部叶片。叶片染病,先在叶尖或叶缘生水浸状绿褐色斑点,病斑周围具浅绿色晕圈。 湿度大时：病斑迅速扩大,呈褐色,产生一圈白霉（孢囊梗和孢子囊）,叶背最为明显。 干燥时：病斑变褐干枯,质脆易裂,不见白霉,扩展慢。 茎部或叶柄染病,显褐色。
马铃薯晚疫病病薯 马铃薯晚疫病病叶
2. 病原 致病疫霉（Phytophthora infestans） 属鞭毛菌亚门疫霉属 菌丝无色无隔膜，孢囊梗无色，具3-4分枝，无限长，在产生每个孢子囊的部位，孢囊梗膨大成节状，节基部钝圆而顶端尖细。孢子囊单胞无色，卵圆形，顶端有乳状突起。 病菌有明显的生理的生理分化，可分为许多生理小种。病菌寄主范围窄，自然情况下只侵染马铃薯和番茄。
3. 病害循环 初侵染：病菌主要以菌丝体在病薯中越冬，也可以卵孢子越冬，但病株茎、叶上的菌丝体及孢子囊都不能在田间越冬。在双季作薯区，前一季遗留土中的病残组织和发病的自生苗也可成为当年下一季的初侵染源。 传播：病菌的孢子囊借助气流进行传播。病薯播种后，多数病芽失去发芽力或出土前腐烂，另一些病芽尚能出土形成病苗。病菌以幼苗茎基部沿皮层向上发展，形成通向地上部的茎上条斑，病苗和病菌长期共存，温湿度适宜时，病部产生孢子囊，这种病苗成为田间的中心病株。病菌能借助土壤水分的扩散作用而被动的在土壤内移动，还可以在病薯与健薯上繁殖。 侵入与发病：低温高湿条件时，孢子囊吸水后间接萌发，内含物分裂形成6-12个双鞭毛的游动孢子，在水中游动片刻后，便收缩鞭毛，长出被膜，成球形，随即长出芽管。当温度高于15℃时，孢子囊可直接萌发成芽管。 再侵染：中心病株上的孢子囊借助气流传播，萌发后从气孔或表皮直接侵入周围植株，经过多次重复感染引起大面积发病。病株上的孢子囊也可随雨水或灌溉水进入土中，从伤口、芽眼及皮孔等处侵入块茎、形成新病薯，尤以地面下5cm以内为多。
4. 发病条件 气候条件：此病是一种典型的流行病害，气候条件对病害的发生和流行有极为密切的关系。以温度，湿度影响最大。当条件适于发病时，病害可迅速爆发。 （孢子囊的形成要求相对湿度在90%以上，而以饱和湿度为最适。孢子囊萌发的方式和速度与温度有关。） 雨水少,温度高,病害发生轻。 品种抗病性:马铃薯的不同品种对晚疫病的抗病性有很大差异。马铃薯对晚疫病菌的抗病性以下两种： (1)寡基因遗传的小种专化性抗病性 (2)非小种专化性的,多基因遗传部分抗病性或田间抗病性。
耕作与栽培措施:地势低洼、排水不良的地块发病重,平地较垄地重。密度大或株形大可使小气候湿度增加,也利于发病。施肥与发病有关,偏施氮肥引起植株徒长,土壤瘠薄、缺氮或黏土使植株生长衰弱,有利于病害发生。增施钾肥可减轻危害。耕作与栽培措施:地势低洼、排水不良的地块发病重,平地较垄地重。密度大或株形大可使小气候湿度增加,也利于发病。施肥与发病有关,偏施氮肥引起植株徒长,土壤瘠薄、缺氮或黏土使植株生长衰弱,有利于病害发生。增施钾肥可减轻危害。
5. 病害控制 (1)选用抗病品种。各地可因地制宜选用不同抗病品种。 (2)选用无病种薯,减少初侵染源。做到秋收入害,冬藏查害、出害、切块、春化等过程中,每次都要严格剔除病薯,有条件的要建立无病留种地,进行无病留种。 (3)加强栽培管理。适期早播,选土质疏松、排水良好田块,促使植株健壮生长,增强抗病力。 (4)发病初期开始喷洒40%三乙膦酸铝可湿性粉剂200倍液,或58%甲霜灵。锰锌可湿性粉剂或64%杀毒矶可湿性粉剂500倍液、60%琥·乙膦铝可湿性粉剂500倍液、72%克露可湿性粉剂700～800倍液、72.2%普力克水剂800倍液、1212200倍式波尔多液,隔7～10天1次,连续防治2～3次。病后10～14天病害蔓延全田或引起大流行。
讨论 不足： • 以DNA为基础的PCR技术不能区别菌种是否为活体。 • 以RNA为基础的PCR技术能克服这个缺点，但由于RNA不稳定且难提取，此方法也受到一定限制。 • PCR扩增只能在实验室下进行，仪器设备要求高，且价格昂贵。 总结： • 分子诊断学技术将会对生物学特征、菌种鉴定、 遗传突变等提供更加准确的数据。
