第十八章 氨基酸、多肽和蛋白质

1. 第十八章 氨基酸、多肽和蛋白质 王 碧 教授

2. 教学目的： 1、了解蛋白质中常见的α-氨基酸的结构特点、分类方法及其 与蛋白质的关系；掌握两性电离和等电点的涵义； 2、掌握α-氨基酸的性质和3种制备方法； 3、掌握肽的涵义和命名方法；了解多肽的一般结构、分析及 合成方法； 4、了解蛋白质的分类方法，以及单纯蛋白质和结合蛋白质的涵 义； 5、了解蛋白质的性质；掌握蛋白质变性的涵义，并从结构上了 解其变性的原因； 6、重点掌握蛋白质的一级结构以及蛋白质分子的肽链中氨基酸 及其排列次序的测定方法；了解蛋白质的空间结构； 7、了解蛋白质的合成方法、原理以及蛋白质的生理功能。 重点：氨基酸的命名、性质和合成方法以及蛋白质的性质。 难点：蛋白质的三、四级结构的理解

3. 18.1氨基酸分子中含氨基的羧酸称为氨基酸 一、分类、命名和构组成蛋白质的氨基酸（天然产氨基酸）都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一个氨基. 氨基酸目前已知的已超过100种以上，但在生物体内作为合成蛋白质的原料只有20种。 α-氨基酸 1. 分类 （1）按烃基类型分类 （2）根据氨基与羧基的相对位置分类

4. （3）根据分子中氨基与羧基的相对数目分 中性氨基酸：-NH2与-COOH数目相等酸性氨基酸：-NH2比-COOH数目少碱性氨基酸：-NH2比-COOH数目多 • 2 命名 • (1)系统命名法 • 构型 (2)俗名 多按其来源或性质而命名，如甘氨酸，门冬氨酸等。 国际上有通用的符号。 用D、L表示构型 -氨基酸 L型-氨基酸 D型-氨基酸 L-甘油醛 用D/ L体系表示:在费歇尔投影式中氨基位于横键右边的为D型，位于左边的为L型。

5. 存在形式：氨基酸都以偶极离子的形式存在。 谷氨酸 丙氨酸 二、物 理 性 质 大部分的氨基酸是无色结晶，高熔点,一般均溶于水，溶于强酸、强碱；难溶于非极性有机溶剂；不溶于乙醚。氨基酸一般有味.酸性氨基酸在水中的溶解度较差；氨基酸的pKa为2左右； 氨基酸在200 ℃以下都是稳定的，加热到熔点（＞200℃）分解； 每一个光学纯的氨基酸都有旋光值。 组氨酸

6. 三、 8个必需氨基酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苏氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 色氨酸

7. 四 、化学性质1. 两性与等电点（1） 两性氨基酸分子中的氨基是碱性的，而羧基是酸性的，因而氨基酸既能与酸反应，也能与碱反应，是一个两性化合物。 注意：即使中性氨基酸的pH也不等于7，当氨基酸电离出的质子大于在水中结合的质子时，氨基酸显酸性，反之为碱性，一般α-氨基酸pH略小于7，即负离子多一些。 氨基酸在一般情况下不是以游离的羧基或氨基存在的，而是两性电离，在固态或水溶液中形成内盐。 当加入酸、碱时，平衡改变，加入酸，平衡左移，正离子增加；加入碱，平衡右移，负离子增加。

8. （2）等电点 氨基酸的等电点：当外液pH为某一值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。 即在氨基酸水溶液中加入酸或碱，至使羧基和氨基的离子化程度相等时溶液的pH值为氨基酸的pI。此时,氨基酸分子所带电荷呈中性——处于等电状态. 在等电点时，氨基酸既不向阳极也不向阴极移动，即氨基酸处于两性（兼性）离子状态。常以pI表示，即当正离子数目等于负离子数目时的pH值为pI。

9. 氨基酸等电点的计算： 各种氨基酸的pI值主要由羧基和氨基的电离常数决定，若分别用K1、K2代表-COOH、NH3+的电离常数，侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸： pI = (pK1 + pK R-COO- )/2 硷性氨基酸： pI= (pK2 + pKR-NH2 )/2 则： pI=(pK1+pK2)/2

10. 不同的氨基酸有不同的等电点，所以可以通过测定氨基酸的等电点来鉴别氨基酸。不同的氨基酸有不同的等电点，所以可以通过测定氨基酸的等电点来鉴别氨基酸。 酸性氨基酸：pI＜7，即pH＜7，一般pI = 2.7～3.2 碱性氨基酸：pI＞7 ，即pH＞7 ，pI = 7.6～10.8 中性氨基酸：pI＜7，即pH＜7，一般pI = 4.8～6.3需注意：a.等电点为电中性而不是中性（即pH=7），其净电荷零。b. 等电点时，以两性离子形式存在的氨基酸浓度最大（在水溶液中），氨基酸的溶解度最小。偶极离子在水中的溶解度最小，易结晶析出。

11. 小 结 • 1.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。 • 2.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电场中向阴极移动。 • 3.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。

12. 具有胺和羧酸的共性 2．氨基酸氨基的反应 （1） 氨基的酰基化 氨基酸分子中的氨基能酰基化成酰胺 应用于保护氨基。 乙酰氯、醋酸酐、苯甲酰氯、邻苯二甲酸酐等都可用作酰化剂。在蛋白质的合成过程中为了保护氨基则用苄氧甲酰氯作为酰化剂，因苄氧甲酰氯的酰基易引入，且对以后应用的种种试剂较稳定，同时还能用多种方法把它脱下来。

13. （ DNP ：二硝基苯基） （2）氨基的烃基化 氨基酸与RX作用则烃基化成N-烃基氨基酸： 应用于氨基酸N端的测定。 （ DNP ：二硝基苯基） 氟代二硝基苯在多肽结构分析中用作测定N端的试剂。

14. （3）与亚硝酸反应 反应是定量完成的，定量的放出N2，测定N2的体积便可计算出氨基酸只氨基的含量。称为范斯莱克（Van Slyke）氨基测定法。 除亚氨基酸（脯氨酸）外，α－氨基酸都能与亚硝酸反应。氨基酸与亚硝酸作用放出氮气，得到羟基酸，放出的氮气一半来自氨基酸的氨基一半来自亚硝酸。 （4）与甲醛反应 用于封闭氨基，滴定羧基。

15. （5）与茚三酮反应 α-氨基酸在碱性溶液中与茚三酮作用，生成显蓝色或紫红色的有色物质，是鉴别α-氨基酸的灵敏的方法。 茚 茚三酮 水合茚三酮 -CO2，-RCHO + -3H2O 互变异构 紫色

16. 这个叠氮化合物与另一氨基酸酯作用即能缩合成二肽 3．氨基酸羧基的反应 氨基酸分子中羧基的反应主要利用它能成酯、成酐、成酰胺的性质。这里值得特别提出的是将氨基酸转化为叠氮化合物的方法（氨基酸酯与肼作用生成酰肼，酰肼与亚硝酸作用则生成叠氮化合物）。 这个叠氮化合物与另一氨基酸酯作用即能缩合成二肽 。 此法可称为叠氮法，用此法合成的肽能保持光学纯度。

17. 4. 氨基酸金属盐络合物的形成 因金属上有空轨道，N上有未共用电子对！ 氨基酸金属盐络合物具有很好的结晶形状, 该反应可用来沉淀和鉴别某些氨基酸。

18. 5. 两分子氨基酸在适当条件下加热，分子中的氨基也可以与羧基相互作用失去两分子水生成二酮吡嗪。 五、氨基酸的制备 氨基酸的化学合成1850年就已实现，但氨基酸的发酵法生产在一百年后的1957年才得以实现用糖类（淀粉）发酵生产谷氨酸。氨基酸的制备主要有三条途径： 即蛋白质水解、有机合成和发酵法。

19. 氨基酸的3种主要合成方法： 1．斯瑞克(Strecher)合成法--醛的氨氰化法 醛在氨存在下加氢氰酸生成α-氨基腈，后者水解生成α-氨基酸。 改进方法： 用NH4CN or NH4Cl+KCN代替HCN+NH3 应 用： 合成比原料醛多一个碳的氨基酸 2.α-卤代酸的氨解 Br2 NH3 RCH2COOH P 在封管或高压釜内进行 此法有副产物仲胺和叔胺生成，不易纯化。因此，常用盖布瑞尔法代替上法。

20. 盖伯瑞尔（Gabriel ）法生成的产物较纯，适用于实验室合成氨基酸。

21. 3．由丙二酸酯法合成 此法应用的方式多种多样. 基本合成路线如下： D，L-苯丙氨酸 合成法合成的氨基酸是外消旋体，拆分后才能得到D-和L-氨基酸。

22. 例. 通过溴代丙二酸酯法合成蛋氨酸 Br2 CCl4 CH2(COOEt)2 BrCH(COOEt)2 ClCH2CH2SCH3 Na 烷基化 NaOH HCl  蛋氨酸（ 50%）

23. 18.2 多肽 一、多肽的组成和命名 1． 肽和肽键 一分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分子的氨基通过脱水而形成的酰胺叫做肽，其中新形成的酰胺键称为肽键。 二分子氨基酸失水形成的肽叫二肽，多个分子氨基酸失水形成的肽叫多肽。 由n个α-氨基酸缩合而成的肽称为n肽，由多个α-氨基酸缩合而成的肽称为多肽。 一般把含100个以上氨基酸的多肽（有时是含50个以上）称为蛋白质。 无论肽链有多长，在链的两端一端有游离的氨基（-NH2），称为N端；链的另一端有游离的羧基（-COOH），称为C端。

24. 2、命名 法则：以含“C”端的氨基酸为母体，将其余氨基酸的“酸”改为“酰”。将“N”端氨基酸写在最前，其余氨基酸依次写出。即根据组成肽的氨基酸的顺序称为某氨酰某氨酰…某氨酸简写：只写头一个字，即写为某—某—某……某肽 -2H2O 甘氨酸 丙氨酸 亮氨酸 肽键 例如： N端 C-端 甘氨酰-丙氨酰-亮氨酸 （甘-丙-亮）（Gly-Ala-Leu）

25. 二 、多肽的结构 1. 肽键和肽的几何形状 2. 二硫键 空气氧化 Na +液NH3

27. 3、多肽结构的测定 多肽结构的测定主要应作如下工作： （1）了解某一多肽是由哪些氨基酸组成的。 （2）各种氨基酸的相对比例和确定各氨基酸的排列顺序。 （3）测定分子中是否存在二硫键 此法的缺点是所有的肽键都被水解掉了。

28. A、 检测氨基酸的组成及其相对比例 现代方法是将水解后的氨基酸混和液用氨基酸自动分析仪进行分离和测定。 B、 测定分子中是否存在二硫键 多肽或蛋白质分子中有二硫键，需要切断。 其方法是用过酸氧化。 C、 测定肽或蛋白质中各氨基酸的排列顺序 端基分析（测定N端和C端） a、测定N端（有2种方法） 在N-端引入具有特定基团的标记化合物，这种标记基 团有颜色、荧光、紫外吸收等性质，然后分离鉴定具有这 种基团的氨基酸衍生物。

29. 方法一：2,4- = 硝基氟苯法——桑格尔(Sanger-英国人)法 缺点：所有的肽键都被水解掉了。

30. 实例： pH=8-9 室温 DNFB + Gly-Ala-Phe H+水解 105oC DNFB-Gly-Ala-Phe DNFB-Gly Ala Phe

31. 方法二： 异硫氰酸苯酯(Ph-N=C=S)法——艾德曼(Edman)降解法。 b 、测定C端 方法一：多肽与肼反应 肼解法： 当蛋白质（或多肽）与无水肼在100℃反应5-10h后，除C端氨基酸外，所有氨基酸都转变成相应氨基酸的酰肼，C端氨基酸则以游离氨基酸放出。

32. NH2-NH2 100oC 5-10h Gly-Ala-Phe GlyNHNH2 AlaNHNH2 Phe 方法二 羧肽酶水解法 4．肽链的选择性断裂及鉴定 部分水解法常用的蛋白酶或其它试剂有： 胰蛋白酶——只水解羰基属于赖氨酸、精氨酸的肽键。 糜蛋白酶——水解羰基属于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的肽键。 溴化氰———只能断裂羰基属于蛋氨酸的肽键。

33. 三、多肽的合成 要使各种氨基酸按一定的顺序连接起来形成多肽是一 十分复杂的化学工程，需要解决许多难题，主要需解决以下 4个问题： 1.氨基保护 2. 羧基保护 3. 侧链保护 4. 接肽方法 保护基必须具备的条件 （1）易在预定的部位引入 （2）在某特定的条件下，保护基很易除去 （3）对保护基的要求是：易引入，之后又易除去，即引入和除去保护基时，分子中的其它部位 不会受到影响，特别是已接好的肽键。

34. C6H5CH2OH+COCl2（光气) 1、保护氨基 （1）用氯代甲酸苯甲酯（或称苯甲氧基甲酰氯）保护 反应过程： Benzoxycarbonyl（简写Z） H+ SOCl2 +NH3CH2CO2- OH- 上保护基 +NH3CH2CO2-, OH- H+ 接肽 （1mol） H2 Pd/C 去保护基 CF3COOH H+

35. （2） 用氯代甲酸三级丁酯保护 t-Butoxycarbonyl 简写BOC 在多肽中的应用： -OH, 25oC 上保护基 CF3COOH HOAc 去保护基 接肽（过程略） *1. 催化氢化和稀碱都不能除去BOC，通常用温的酸性水解法除去。 *2. 若氨基酸中有多个氨基，在接肽前均需保护。 *3. 用Z保护还是用BOC保护，视实际情况而定。

36. 2、 羧基的保护 A HCl CH3OH 接肽 去保护基 Na2CO3 上保护基 Pd / H2 A 接肽 去保护基 上保护基 H3+O 去保护基 (CH3)2C=CH2 A 接肽 上保护基 使用的酸为：CF3COOH HBr / HOAc A代表：

37. 3 侧链的保护 当氨基酸的侧链带有某些官能团时，在合成多肽时，有时也需要加以保护，保护的方法，要视具体情况而定。 例如： 上保护基 Na, NH3(l) 去保护基 空气中氧化 巯基经常用苯甲基保护，保护基可以在钠、液氨作用下除去。

38. 4、 接肽的方法 （1）、 混合酸酐法（活化羧基） -OH, 25oC N(C2H5)3 -5-0oC C6H5CH2OCOCl -(C2H5)3N•HCl 接肽 H2/Pd-C

39. （2） 、 活化酯法 N(C2H5) 3 H+

40. （3）碳二亚胺法接肽 dicyclohexylcarbodimide (DCC) 接肽 H2 / Pd-C 去保护基

41. 失水机制 二环己基脲

42. 5. 生物活性 合成多肽必须保证氨基酸的排列顺序与天然多肽相同，并与天然多肽不论在物理、化学性质和生物活力各方面都一样，才具有意义。我国1965年6月发表合成成功牛胰岛素的文章，生物活性1.2~70%西德…………7月………………羊………………，…………0.5~10%美国1967年发表文章（胰岛素合成方法的改进）前苏联1972年发表文章（胰岛素合成方法的改进）胰岛素是一种激素，可用于治疗糖尿病，但只能用和人体结构相近的胰岛素，如猪胰岛素，其它的则不起疗效。 几种哺乳动物胰岛素的氨基酸顺序的差异 A链B链 8 9 10 30 人苏丝异亮苏 猪………丙 牛 丙 …缬 … 马 …甘 …… 羊 …………

43. 18.3 蛋白质 是由酰胺键形成的高分子，分子量在10000以上（约100个氨基酸以上），构型复杂的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子的概念 蛋白质分子：蛋白质是分子量很大的生物分子。由一条或一条以上的多肽链按各自特殊的方式组合而成的具有完整生物活性的蛋白质的最小单位。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。 对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。

44. 蛋白质的元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，所有蛋白质都含有C、H、O、N，大多数蛋白质含有S，某些蛋白质还含有少量的其它元素。主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50％-55% 氢 6.5-7.3％ 氧 19-24％ 氮 15～18% 硫 0-4％ 其他 微 量

45. 蛋白质的含氮量 • 大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： • 蛋白质含量=蛋白氮 6.25 • 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）

46. 蛋白质的水解 组成蛋白质分子的基本单位——氨基酸 蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.

47. 完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。 • 所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元（基本组成单位），是指含有氨基的羧酸。 • 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。

48. 一、蛋白质的分类 1.根据蛋白质的形状分为： （1）纤维蛋白质 如丝蛋白、角蛋白等； （2）球状蛋白质 如蛋清蛋白、酪蛋白、血红蛋白、γ-球蛋白（感冒抗体）等。 2．根据组成分： （1）单纯蛋白质——其水解最终产物是α- 氨基酸。 （2）结合蛋白质——α- 氨基酸 + 非蛋白质（辅基） 3.根据蛋白质的功能分： （1） 活性蛋白 按生理作用不同又可分为；酶、激素、抗体、收缩蛋白、运输蛋白等。 （2）非活性蛋白 担任生物的保护或支持作用的蛋白，但本身不具有生物活性的物质。

49. 二、蛋白质的主副键 • 主键：肽键 • 副键：盐键、二硫键、酯键、疏水作用等，对蛋白质的 • 构象，稳定起着极其重要的作用。 • 盐键：多肽键上的游离羧基与氨基可形成盐键，静电作 • 用，属离子键，对于维系蛋白质构型不太重要。 • 2.酯键：易受酸碱破坏。 • 3.二硫键：起交联作用。 • 4.氢键：对于稳定蛋白质的构象，起极重要的作用。 • 5.疏水作用：主要对于三级、四级结构的构象稳定起重要作用。

50. 三、 蛋白质的结构 1．蛋白质的一级结构或初级结构 指蛋白质分子中氨基酸（50个以上氨基酸）连接成肽链的方式和排列顺序。一级结构是蛋白质最基本的结构,它是由基因上遗传密码的排列顺序决定的,也称为肽链结构、化学结构。它是蛋白质生物功能的基础。 蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 蛋白质一级结构的测定与多肽链测定方法类似.