ДЕЙЧМАН А.М Лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДИТО, РОНЦ

1. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ (ГЕНЕТИЧЕСКАЯ) РЕГУЛЯЦИЯ, ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТЕКСТ И ГИПОТЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ/ГЕНОМА. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ДЕЙЧМАН А.М Лаборатория экспериментальной диагностики ибиотерапии опухолей НИИ ЭДИТО, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

2. П. и Д. Медавары: «Генетика предполагает, а Эпигенетика располагает»ТЕЗИСНО:1.ТЕРМИН «ЭПИГЕНЕЗ/ЭПИГЕНЕЗИС» - от Аристотеля (и средневековых естествоиспытателей)2.ТЕРМИН «ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ/НАСЛЕ-ДОВАНИЕ» – в 40-х годах ввел британский ученый КонрадУоддингтон, ... Роб.Холлидей в 1990 г. ...

3. БФВ: Эпигенетика: область знаний о совокупности свойств организма, которые непосредственно не закодированы в геноме, но могут и, по определению, должны передаваться по наследству. • Сходное: Эпигенетика изучает стойкие изменения, влияющие на геном особи в течение развития и старе-ния, но не обязательно передающиеся следующим поколениям. • Andrew Feinberg(Professor of Medicine and director of the Center for Epigenetics in Common Human Disease at Johns Hopkins): “Cells affected by epigenetic changes look normal under a microscope at low levels of resolution, but if you look carefully at the genome, you find there are subtle changes (тонкие изменения)."; и: “(Отслеживая эти изменения, врачи могли бы лечить людей, прежде чем опухоли разовьются, – во многом так же, как кардиологи назначают для снижения уровня холестерина препараты, чтобы помочь предотвратить сердечные заболевания.)”

4. Механизмы эпигенетическогорегулирования:1. Метилирование ДНК (ядерной, реже митохондриальной).2. Ремоделирование  упаковкихроматина («Гистоновый код»: модификация гистонов: метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинирование; другие белки). «Нуклеосомн.-код».3. РНК-интерференция (с участием малых РНК, направляющих метилирование, модулирующих трансляцию, транскрипцию; siRNAs, rasiRNAs, piRNAs, snoRNAs др.). 4.Конформационнаяприонизация белков. 5. Инактивация одной из двух X-хромосом у самок (женщин). Импритинг.

5. Парамутации, Эпимутации растений / животных (у цветковых и млекопитающих; легко ревертируют к норме). Считают: за этими явлениями стоит некий общий и доволь-но широко распространенный механизм, однако он, несмо-тря на большой интерес к проблеме, не расшифрован. • Эухроматин (малая часть генома). Гетерохроматин(~80% генома; факультативный и конститутивный). Локальная гетерохроматизация Центромер, Теломер (у человека / млекопитающих – это TTAGGG-повторы), Alu/LINE/SINE-повторов. • Чадов Б.Ф.: 1. Генетическая система, считающаяся нами управляющей, оказывается управляемой, а управ-ляющей оказывается та, о которой как о системе нам фактически ничего не известно… 2. «...благоприоб-ретенный признак, даже эпигенетический, не может не иметь генетической основы». • Механизмы запуска эпигенетических регуляторов до сих пор не ясны полностью.

6. Метилирование ДНК( репликативно- / пострепликативно ). «Волны метиливания /деметилирования». Видо-/ткане- / /органо - специфичность. Возраст. Гормо-ны. Ядро (митохондрии). Отдельные уча-стки генома. Контескст (нуклеотидный). Контроль (репликации, транскрипции, репарации ДНК, рекомбинации, транспо-зиции генов, включая онко -/ гены-суп-рессоры). С эмбриогенеза. Диагностика. Замены G/C- на А/Т-пары.

7. Анализ показывает: Изменения в профилях экспрессии белков, малых РНК, метилирования (др. эпигенетических меток, идут параллельно в процессе роста / раз-вития / дифференцировки – в норме и при пато-логии).Некодирующая часть генома. Гене-тические сети. «ГИСТОНОВЫЙ КОД»: касается всех гистонов (Н1,Н2А, Н2В,Н3,Н4). Регуляторная «игра» идет по сочетанию: 1. способов модификации; 2. сайтов модификации; 3. числу меток у каждого сайта • Лизин. Серин/Треонин. Аргинин. Дрожжи. Мышь.

8. Онкологические аспекты(в отношении эпигенети-ческих факторов): Соображения (группы исследователей из США и Швеции):Первые шаги к развитию рака проис-ходят не на генетическом, а на эпигенетичес-ком уровне. Они выделяют три стадии: 1.) эпигенетические изменения и ненормальная регуляция клеток. Опухоли нет, но условия складываются. 2.) в популяции измененных клеток происходит мутация, начало развития рака. 3.) генетическая и эпигенетическая нестабильность, рост/«эволюция» (ПРОГРЕССИЯ) опухоли. Тотальное деметилирование (гипометилирование; мно-жества одиночных CpG-сайтов) и локальное гипер-метилирование (~20% сайтов, в CpG-островках) ге-нома. Метилирование и транскрипция связаны обрат-ной зависимостью (совершенно необходим трансак-тивирующий белковый фактор).

9. Эпигенетический эквивалент генетической мутации: • Пример: Эпимутации(состояли в de novoгипер-метилированиипромоторной областиMLH1-гена у пациентов с HNPCC-раком, в различных клетках)... Оказалось, что слабо наследуемые эпимутации, вызывали такой же клинический HNPCC-эффект (фенотип), как и сами мута-ции.... Группа повышенного риска (гипермети-лирование + микросателлитная нестабиль-ность). (Эпимутации≈Парамутации). • Заметка: При лейкозах животных тотальное ДНК-мети-лирование (в L-клетках (фибробл?)) понижено, а в не-кодирующих межгенных палиндромных областях генома метилирование было повышенным.

10. ГИПОТЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ / ГЕНОМА. ТЕЗИСНО (почти все опубликова-но, рисунки/схемы см. ниже): • Предложен новый гипотетический механизмвоспроизведения олигонуклеотидных после-довательностей длиной в (15-30)n- нуклеоти -дов. Как и малые РНК они используются в соответствии клеточной программой (роста / развития / дифференцировки; при патологии, в частн. онкологии, все меняется). • Это механизм вариабельной Поэпитопной Обратной Трансляции (вПОТ-механизм), протекающий в митохондриях (растения: + хлоропласты). Локализован на внутренних мембранах органелл. • Другое название олигонуклеотидов – Нуклеиновый Эквивалент (НЭ) эпитопа (длиной в 5-10 аминокислот).

12. 4. Для процесса необходимытРНК (Аа-тРНК), эпитоп и активности (полимеразные: RdRp, DdRp, RT; экзо-/эндо-нуклеазные, лигазная, протеазная, другие). 5. «Ретранслосома» – гипотетическая полифункцио - нальная самоорганизующаяся частица (функция: олигопептид→олигонуклеотид). Имеются нано-молекулярные компоненты (тРНК, эпитоп). Взаи - модействуют разные уровни организации клетки («живого вещества»). 6. «Рибо-(или ДНК)»-вариант олигонуклеотида (НЭ) может встроиться: 1. в мтДНК; 2. в ретровирусо-подобный вектор (импорт в ядро/геном); 3. комплексироваться с белками (импорт в ядро / цитоплазму). 7. Достижение целей(регуляторных, защитных и эволюционных).

13. 8. Размер олигонуклеотида, НЭ-та (единичные / / амплифицированные варианты) соответствует таковому для: а) коротких РНК (20-30 нуклеотидов). Компле-ментарное и конкурентное взаимодействие НЭ с короткими РНК (контролирующими ...) и их мРНК-мишенями; (см. рис.) б) праймерных затравок при репликации митохондриальной / хромосомной ДНК; в) другое (ред-РНК-«кассеты», gRNAs, …). (ПЦР). 9. Тогда НЭ может вмешиваться в процессы репликации, транскрипции, трансляции, процессинга / сплайсинга (и другие: целостность некодирующей части генома, ...). Daphne W Bell (Cancer Genetics Branch, National Human Genome Research Institute): …“opened up the potential to resequence entire tumour genomes to interrogate protein-encoding genes, non-coding RNA genes, non-genic regions and the mitochondrial genome...

14. Рис 1. Схематическое изображение роли miRNAs в регуляции инвазии и миграции опухолевых клеток (В целом, miRNAs также играют различные роли при канцерогенезе и включаются в процессы миграции, инвазии, метастазирования, пролиферации и клеточного цикла)

15. 10. вПОТ-механизмнапряженноработает в Мт / клетке (чувствителен к факторам внутр/внешн сре-ды). Единичные / амплифицир - вариантыНЭ. Подобие с повтор-послед-ми. Рибоперекл-ли метаболизма (сах /железа, как у бакт.); РНК-аптамерныеструктуры. Отдельные / кластеры рибонукл-в в: 1. мтДНК животных (особ. в отстающей нити); 2. ядДНК эукариот / прокариот. Участие коротких РНК (ДНК) врепарации ядерной ДНК (дрожжи). Митохондрии: число, асинхронность, изменчивость, старение (радикалы, АФК); связь с ядерной ДНК: энергетика / биохимия /регуляция; + у в.растений в ядерной ДНК: есть динамические сайты для мтДНК и хпДНК (> 3000 kb). мтДНК: ... анал-сайты для ядДНК. 11. Эпитопыизбыточных/поврежденных собственных (клеточ / внеклет) и чужеродных белков. Протеасомы(лизосомы,фаголизосомы при имм. - ответе). 12. Замкнутая обратная связь регуляции экспрессии генов / генома с участием митохондрий, ядра, цитоплазмы (... по собств / чуж белкам ... по нуклеотидным последователь-ностям). Сочетание регуляторной, эпигенетической и генетической компонент.

16. 13. (1) Регуляция экспрессии генов (стандарт-ная): комплементарно-конкурентное взаимодействие НЭ с малыми РНК и ихмРНК / РНК - мишенями. 14. (2) Эпигенетическая регуляция: стойкое, отчасти наследуемое: 1. переключение активности ферме-нтов (метилирования, ацетилирования, фосфорилирова-ния, убиквитинирования, де-/... и т.д.); 2. внедрение, вре-менное / постоянное пребывание НЭ-содержащих векто-ров в некодирующей части генома [в повторах, что возмо-жно ведет к: i). MIs;ii). созданию «порочных регулятор- ных циклов»,др., - вблизи / дистантно от соответствую - щих генов (включая онко -/гены-супрессоры); iii). активац путей с участ: а) процессир / непроцессир псевдогенов (напр., PTENP1, необх. для экспресс-PTEN-онкосупресс-гена, с кот. вз-т множ-во микро-РНК и ...; и KRAS идр.), и b) др. РНК (рРНК, мРНК, lincRNAs)].Запуск эпиген-событий не ясен, но это м вести, в частности, к Генетическим Заболеваниям.

17. 15.(3) Генетическая компонента, в целом: стабильность и изменчивость, поддерживается как самим НЭ (поступающим в геном в составе векторов), так и перемещением НЭ-содержащих векторов. (см. далее). вПОТ (Мт)→НЭ→ВНП (ретро- / транспозон с НЭ):1. яд-ДНК (повторы +/→ интроны +/→ экзоны); 2. обратным сплайсингом в РНК (интроны / экзоны: мРНК, рРНК, тРНК); и далее обратной транскрипцией в ДНК-участки). вПОТ (Мт)→ НЭ → РНП (НЭ): цитоплазма (трансляция) + ядро (структура хроматина: транскрипция, транскрипционный сайленсинг, рекомбинация, др.). Многое из этого касается и эпигенетической компоненты. Интересно, что, подобно СН3-ДНК, увеличение активности спец-х микро-РНК (miRs-103/107; при раке молочной железы) сопрово - ждается общим падениемглобальной экспрессии микро-РНК (за счет ингибирования экспресс Dicer-нуклеазы) в эпителиальных формах, с последующим усил-ем миграции и метастатич. - диссе - минациимезенхимальнымиклеточнымиформами рака при EMT.

18. 16.Почему «РАК может быть “очень долго”»). Чураев Р.Н.: Феномен наследственности – проявление Закона Сохра -нения Информации... «Возможнымежклеточные взаимодействия генных сетей разных клеток (сигналы из внутренней среды органи-зма)... Современные данные можно увязать и с “пангенезисом” Ч.Дарвина и с “зародышевой плазмой” А.Вейсмана»....Этот резуль-тат оправдывает поиски дополнительных (регуляторных, защитных, эволюционных) механизмов». Эгоистические гены. Корочкин Л.И.(перенос РНК регуляторных белков: трофоцит→ооцит). Доступный трансгенез(SMGT-ДНК+RT-SMRGT-РНК):(экспер: захват экзо-нукл-по-сл. спер-м, перенос в ооцит; не искл для эндо-ген-вар-в). Оценив-ся пока как широко распростран/неслучайн (в отнош ретро-эл-в), но - непонятная возможность. (Интересно, что для пе-реноса ДНК [в слабо-СН3-сайты-хроматина] треб-ся DBP/CD4-комплекс, а нов-RT-стадия, при участэндог -LINE-1,обязательна). Множ-во стадий, на кажд – потеря ген-матер-ла, но принцип имеющ место-б. Эписомальн-ДНК/РНК – как парамутац (с не-Мендел-нас-лед-м). ОловниковА.М.:Парагеном (принтомер -/хромомер- (соматич-кл) / филомер (в обогащенн повторами: полов кл-х и В-хромос-х). Не являются единственными «регуляторами регуляторов». ГСК: Гематопоэтические стволовые клетки(нет точного понима - ния мол.-механизмов их дифференц-ки и репрограммирования).

19. 17.Процессы, к которым также могут быть «прича-стны» вПОТ/ВНП-передачи-механизмы (вкл. он-кологич.): 1) EMT (в частн., при участии микро-РНК; следующий слайд). 2) Трансдифференцировка(кл-ки глиобластомы как-буд «прев-ращ» в кл-ки эндотелиясосудов опухоли [по маркер и ген.- пере-стройкам]; то же для: лимфомы, миеломы, хронической миелоидной лейкемии (CML), рака молочной железы, нейробла-стомы. Однако: мб недооценена роль (псевдо)-горизонтального переноса (множества ВНП-пер.) между кл-ми (одной / разных тканей). 3) Хромотрипис (сверхбыстрые дробление / соединение частей хромосомы: десятки-сотни перестроек в одной/нескольких хромосомах 2-3% всех раков, и >25% раков кости; ; идет сбли-жение и перетасовка ранее отдаленных генов и их частей в кажд хромосоме. Несколько механизмов: 1. «изнашивание теломер»/слияние концов хромосом; 2. делеция генов – супрессоров; 3. амплификация онко -/генов; 4. взрывы соматических мутаций). 4) Эффекты при Онкологии (регуляторные/эпи-/генетические; вПОТ/ВНП-передача-механизмы м: влиять на сами опух.-кл; кл-ки окруж. их тканей; имитировать роль имм.-АПК).

20. Рис 2. Роль miRNAs в метастазировании.(a) EMTрегулируетсяmiRNAs(рак простаты). miR-200, miR-205 усил-т мезенхим-ю направл-ть при экспресс-транскрипц-факторов ZEB-1/2, аmiR-101– блокирует экспрессию E-кадхерина(через таргетинг EZH2, Zeste Homolog 2). miR-155усиливает: 1. активность Rho-фактора и2. TGF-Smad-путь; все вместе это предрасполагает к метастазированию.(b) Усиление метастазирования (при раке молочной железы) с помощ.- miR-10b– первой из идентифицированных; связана с Twist1, MMPs, активатором урокиназы плазминогена(uPA), и различными интегринами. Запуск про-метастатическихmiR-373иmiR-520cусил-л метастазирование (при модулировании CD44) в кости и легких; а miR-21при этом угнетает экспрессию TPM1, PDCD4. Другие miRs:miR-335, miR-206 и miR-31идентифицированы как антиметастатические и тарге-тируют RhoA-/Fzd3-/RDX-факторыиинтегрины.Усиление экспрессии miR-146 и miR-98/let-7 вело, соответственно, к таковой же для супрессирующих метастази-рование факторов BRMS-1 и RKIP.

21. 5) Возможная сопряженность с редактированием РНК(необходимость в напр. - матрице при A→I у животных, и U-вставочно-делеционном gRNAs-редактировании утрипаносом), др. (слайд 24) 6) Возможнаясовместная изменяемость геномов клетки и вируса(в частности ретровирусов). 7) Генетическая компонента приЛекарственной Устойчивости. 8) АГ-специфические участкив АТ и рецепторах В-/Т-клеток (слайд 23). 9) Другое(феногенотипическое равновесие: преобразование соотношений АТ↔GC-пар, пуринов↔пиримидинов; отбор более востребованных белк.-версий (слайд 24), др.). Отдельно: 10) Формирование генетического кода(разнообразия в его рамках; слайд 23,26). Биосфера, единая генетически и экологически (ГЧОС-система). 11)Динамическая синхроннаяконсервативность – скрытый вид вариабельности (слайды 23, 24). 12)Специфический иммунный ответ (слайд 23) → врожденный. 13) И т.д.