Download
1 / 11
110 likes | 263 Views
聚合酶链反应. （一） PCR 技术（聚合酶链反应） ⒈原理： PCR 技术实际上是 DNA 体外扩增技术，其原理为： ①以提取的 DNA 为模板，在94℃解链变性后提供单链 DNA 模板（模板变性） ②将特定设计的与待扩增 DNA 模板两端序列互补的两个引物（短链互补 DNA 引物）经低温退火使引物与模板 DNA 互补结合（模板与引物退火连接）
E N D
聚合酶链反应 （一）PCR技术（聚合酶链反应） ⒈原理：PCR技术实际上是DNA体外扩增技术，其原理为： ①以提取的DNA为模板，在94℃解链变性后提供单链DNA模板（模板变性） ②将特定设计的与待扩增DNA模板两端序列互补的两个引物（短链互补DNA引物）经低温退火使引物与模板DNA互补结合（模板与引物退火连接） ③在PCR反应中，在Taq酶（DNA聚合酶）作用下，使加入的游离单核苷酸（dNTPs）由引物5′ 3′方向按碱基配对原则，沿DNA模板形成两条互补DNA链。（引物沿模板互补延伸）如图 新合成的DNA链又可作为下一轮PCR反应的模板，这种经热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，经反复多次循环可产生2n的指数扩增，使微量模板达可见量用于实验。 其引物设计、 PCR反应条件、仪器稳定性、技术性强，对环境要求严，以防假阳性产生。
⒉PCR种类：种类多、用途多而广泛，列举常用法⒉PCR种类：种类多、用途多而广泛，列举常用法 ⑴逆转录PCR（RT-PCR）：又称RNA-PCR 先将从细胞总提取的总RNA，在逆转录酶的作用下合成cDNA（序列用mRNA）以提供PCR模板。然后以cDNA为模板在互补的两个引物的引导下，在Taq酶作用下，将加入的dNTPs按碱基配对原则，沿cDNA 模板扩增DNA（见上图） 优点：①只需少量mRNA 模板cDNA ②cDNA中已不含内含子 ③对构建cDNA文库非常有利 ⑵锚定PCR：当mRNA cDNA后，用末端转移酶在cDNA3′末端加上poly(dG)作锚位，然后用带有酶切位点的poly(dC)作锚定引物 ，进行PCR扩增。 优点：可克隆和扩增未知的DNA/RNA、基因序列，便于组装，免受基因两端序列限制。
⒊反向PCR：能将位于已知基因序列两侧的未知序列（转座子、插入序列、易位整合的插入基因）扩增获得。⒊反向PCR：能将位于已知基因序列两侧的未知序列（转座子、插入序列、易位整合的插入基因）扩增获得。 方法：选择已知序列内部没有该酶切位点的内切酶，对DNA进行酶切，经环化后，将环化分子用与已知序列两端的互补反向引物进行PCR扩增，可获大量的未知DNA片段，进一步测序。（图） 反向PCR 对研究转座子、反转录病毒插入序列以及所有可以整合或转位到基因组（已知序列）中的插入序列DNA片段（如原癌基因）。
⒋随机引物PCR 以合成一系列不同随机排列的寡核苷酸链（通常为10聚体）为引物，对基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物经丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，EB染色显条，分析DNA多态性。 此法可通过扩增产物DNA片段多态性，可分析基因组相应区域的DNA多态性，被命名为随机扩增的多态性DNA(RAPD)。 RAPD可用于基因组指纹图的构建，可应用于系统进化研究、物种鉴定和亲缘关系分析，法医可用来作亲子鉴定。
⑸单链构象多态性PCR（SSCP） 不同肿瘤由于单链DNA分子中因单一核苷酸不同，其DNA的二级结构的构象有差异。 PCR产物电泳后的DNA迁移率不同，其电泳条带上有差异。通过比较DNA的电泳类型，即可测出基因的点突变、插入、缺失突变等。 此时若用Southern印迹杂交更为精确。 ⑹其他PCR技术 ①差异显示RT-PCR：复杂、引物多、费用大、操作技术要求高、假阳性高，不常用。 ②俘获PCR：技术复杂，不常用。
核酸分子杂交 ⒈Southern blot（又称Southern印迹杂交） 提取基因组DNA，经酶切后电泳分离，将分离定位在凝胶上不同分子量DNA条带，用碱变性处理，使双链拆开，再如图转移到硝酸纤维素膜上，用标记的目的DNA探针进行同源DNA杂交。带有核素标记的DNA探针结合后，经洗涤仍留在膜上，经X-光片显影定影，根据标记信号，证实基因组DNA靶分子上是否含有目的基因探针的基因片段。 方法：①虹吸印迹法：利用毛细管虹吸作用将凝胶上DNA片段转移到膜片上，转移时间长，需过夜或在12~18h之间，探针与膜杂交。 ②真空转移法：采用抽真空技术将凝胶上缓冲液引流至下槽中，可快速将凝胶上DNA片段转移到膜片上。方法①凝胶在下，膜片在上，方法②凝胶在上，膜片在下。如图
⒉Northern-blot（又称Northern印迹杂交） Sorthern杂交样品是DNA，而Northern杂交样品是RNA。 RNA样品的变性、电泳转移方法与Southern杂交法相同，其标记的杂交探针可以是DNA，也可以用RNA特异探针。 本法可从RNA水平研究基因的表达。 ⒊斑点杂交 是Sorthern-blot 法衍生而来的快速、简便的鉴定微量DNA样品的技术。 可直接将样品DNA点于硝酸纤维素膜上，固定后先预杂交，再用核素标记的特异探针在密封袋中进行杂交，有斑点产生者为阳性。还可根据斑点大小，进行相对定量分析。 具有快速、简便、只需微量样品、反应体积小、无需转膜及其相关设备。 缺点：难于确定被测基因片段的分子位置。
⒋原位杂交：用标记已知DNA序列的探针，使其与细胞或组织切片中核酸进行杂交。此法因基因组DNA各基因位置未发生改变，故称原位杂交。⒋原位杂交：用标记已知DNA序列的探针，使其与细胞或组织切片中核酸进行杂交。此法因基因组DNA各基因位置未发生改变，故称原位杂交。 有两种方法： ①核素标记的DNA探针滴在细胞涂片或组织切片上，43℃作用18h。经洗涤干燥后，涂核4乳胶，于4℃自显影，定影，Giemsa染色。计算镜下的银色颗粒数。也可用图像仪进行灰度分析，可定点、定量分析。 ②地高辛标记DNA探针的原位杂交 方法与上述基本相同，只是探针不用核素标记该用地高辛标记，杂交后经洗涤再加入酶标记的抗地高辛抗体，作用20min洗涤，并用EDTA液终止反应，再加入相应底物显色，镜检。
