第十五章厌氧菌

第十五章厌氧菌 第一节概念、种类与分布是指一大群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件下才能生长的细菌。主要可分为两大类，一类是有芽胞的G+梭菌，另一类是无芽胞的G+及G-杆菌与球菌。

无芽胞厌氧菌在临床厌氧菌标本检出率中约占90％,分布广泛，多为条件致病菌；厌氧菌的感染遍及临床各科，且多为混合感染；对氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲硝唑(灭滴灵)普遍敏感,无芽胞厌氧菌在临床厌氧菌标本检出率中约占90％,分布广泛，多为条件致病菌；厌氧菌的感染遍及临床各科，且多为混合感染；对氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲硝唑(灭滴灵)普遍敏感, 40多个菌属，300多个菌种。有芽胞厌氧菌只有梭菌属，共130个种。

无芽胞厌氧菌同需氧菌与兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群,其中厌氧菌占有绝对优势，例如肠道菌群占99．9％。正常情况下菌群之间保持着微生态平衡，厌氧菌代谢产生的乙酸、乳酸等能抑制病原菌生长。如长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，在发生菌群失调或机体免疫力下降或细菌进人非正常寄居部位时，这些厌氧菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染。无芽胞厌氧菌同需氧菌与兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群,其中厌氧菌占有绝对优势，例如肠道菌群占99．9％。正常情况下菌群之间保持着微生态平衡，厌氧菌代谢产生的乙酸、乳酸等能抑制病原菌生长。如长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，在发生菌群失调或机体免疫力下降或细菌进人非正常寄居部位时，这些厌氧菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染。

(一)厌氧菌感染的条件 1.组织缺氧或氧化还原电势(Eh)降低可造成厌氧菌生长的适宜环境，易于遭受厌氧菌感染。 2.机体免疫功能下降，如老年人、早产儿, 接受免疫抑制剂、抗代谢药物、放射或化疗治疗的患者，其全身免疫功能受损或降低，厌氧菌感染率相当高。

3.长期应用氨基糖甙类抗生素，或长期应用头孢菌素、四环素等无效者，均可诱发厌氧菌感染。3.长期应用氨基糖甙类抗生素，或长期应用头孢菌素、四环素等无效者，均可诱发厌氧菌感染。 4.需氧菌、兼性厌氧菌的混合感染。需氧菌生长耗竭了氧气，有利于厌氧菌的生长。

(二)厌氧菌感染临床细菌学指征 1.感染局部产生气体，组织肿胀和坏死。 2.粘膜附近的感染。 3.深部外伤的继发感染，流产胃肠手术后发生的感染。

4.分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外 光下发出红色荧光。 5.分泌物涂片镜检有细菌，而常规培养阴性者；或在培养基深部长的细菌。 6.长期应用氨基糖甙类抗生素治疗无效病例。

第二节厌氧性细菌的检验 (一)采集标本不能被正常菌群污染；应尽量避免接触空气。最理想是能取得组织标本。下列标本无送检价值，不宜做厌氧菌培养：①鼻咽拭子；②齿龈拭子；③痰和气管抽取物；④胃和肠道内容物、肛拭；⑤接近皮肤和粘膜的分泌物；⑥褥疮溃疡及粘膜层表面；⑦排出的尿或导尿；⑧阴道或子宫拭子；⑨前列腺分泌物。标本运送中应尽量避免接触空气。不要冷藏。

(二)直接涂片·染色镜检 结合标本来源，性状与气味，可提供许多有用的信息,对估计标本中含菌量、细菌种类和选择培养基等都有意义。标本发臭，镜检发现细菌染色不均，形态奇特者常是厌氧菌的表现。如两端钝圆着色深，中间着色浅不均匀，且有空泡，长短不一的革兰阴性杆菌常脆弱类杆菌。

标本呈琥珀酸味，带血性或用紫外灯照射发红色荧光，涂片镜检为G-球杆菌，间或有长短不一的多形性，并有恶臭者，常为产黑色素普雷沃菌。标本呈琥珀酸味，带血性或用紫外灯照射发红色荧光，涂片镜检为G-球杆菌，间或有长短不一的多形性，并有恶臭者，常为产黑色素普雷沃菌。菌体细长，两端尖, 为梭形的G-杆菌，有紫色颗粒沿菌体长轴排列，成双排列尖端相对，并有丁酸臭味者，常是具核梭杆菌。菌体高度多形性，长短不一，菌体中部肿胀或呈圆球者，可能是坏死梭杆菌。

极小的G-球菌，可能是韦荣球菌。 G+无芽胞杆菌，呈乳酸气味者，可能是乳酸杆菌。呈丙酸气味者，并有特殊排列呈X、Y、或栅状者可能是痤疮丙酸杆菌。有醋酸气味的可能是双歧杆菌。菌体分枝，呈棒状或栅状排列，且发现黄色颗粒，有琥珀酸气味者，多是放线菌。

G+芽胞杆菌，肯定是梭状芽胞杆菌属。 G+短粗两端钝圆杆菌，无芽胞，中性粒细胞也很少且变形破碎，标本来自战伤或肢体严重肿胀者，大多是产气荚膜梭菌。 G+杆菌，有芽胞，并有异丁酸或异戊酸等气味，标本来自抗生素相关性肠炎者，大多是艰难梭菌。

（三）厌氧菌培养基 1)强化血琼脂平板(BAP)：即布氏琼脂或牛心、牛脑浸出液琼脂为基础培养基，补加酵母浸膏(0．5％)、动物血(5％～10％)、维生素k1(0.1μg／ml)和氯化血红素(5μg／ml)，是一种非选择性培养基，几乎能培养出所有的厌氧菌。

2)卡那—万古霉素冻溶血琼脂平板(KVLB)： 可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期形成黑色素。只需2—3d出现黑色菌落。绝大多数类杆菌属、普雷沃菌属和紫单胞菌属都生长良好，梭杆菌和厌氧球菌不能生长。是常用的选择性培养基。卡那霉素含量为75—100μg／ml，万古霉素为75μg／ml。

3)七叶苷胆汁平板(BBI)：本培养基含20％胆汁，1g／L七叶苷和100μg／ml的庆大霉素。抑制需氧菌，胆汁抑制对之敏感的厌氧菌。只有耐胆汁的脆弱类杆菌与可变梭杆菌和死亡梭杆菌不被抑制，反被刺激菌落较大，还能水解七叶苷，菌落周围有棕黑色的晕。3)七叶苷胆汁平板(BBI)：本培养基含20％胆汁，1g／L七叶苷和100μg／ml的庆大霉素。抑制需氧菌，胆汁抑制对之敏感的厌氧菌。只有耐胆汁的脆弱类杆菌与可变梭杆菌和死亡梭杆菌不被抑制，反被刺激菌落较大，还能水解七叶苷，菌落周围有棕黑色的晕。

4)卵黄平板(EYA)和兔血平板：用于选择产气荚膜梭菌，标本接种兔血平板，见有双溶血环，内环是与菌落一样大小的透明溶血，外环是宽的甲型溶血，放半小时后菌落变绿色或褐色，同时可接种卵黄平板，以进行卵磷脂酶试验鉴定产气荚膜梭菌。4)卵黄平板(EYA)和兔血平板：用于选择产气荚膜梭菌，标本接种兔血平板，见有双溶血环，内环是与菌落一样大小的透明溶血，外环是宽的甲型溶血，放半小时后菌落变绿色或褐色，同时可接种卵黄平板，以进行卵磷脂酶试验鉴定产气荚膜梭菌。

(四)厌氧菌培养常用方法 1)厌氧罐培养法：应用物理或化学方法造成无氧环境。如冷触媒法：利用气体发生器产生氢及二氧化碳，产生的氢在触媒作用下，与罐内的氧结合成水，将氧消耗掉，造成无氧环境。产生的二氧化碳约为10％，也适宜厌氧菌生长。方法为：先将触媒(金属钯或铂)及美蓝指示剂放入罐内，然后将已接种的平板置于罐内，将气体发生袋的指定角剪开，加入lOml水，立即放入罐内，封闭厌氧罐即可。

2)气袋法：原理相同，只是将厌氧罐用无毒、透明的塑料袋代替。 3)厌氧手套箱培养法：厌氧手套箱公认的培养厌氧菌最佳仪器。它是密闭的大型金属箱，前面有透明面板，板上装两个手套，可通过手套在箱内进行操作。适用于在无氧环境中连续进行标本接种、培养和鉴定等全部工作。

(六)鉴定试验 据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。 1．形态与染色不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也为鉴定厌氧菌提供参考依据。

2．菌落性状 不同厌氧菌其菌落形状和性质不同。梭菌的菌落特点是形状不规则，而无芽胞厌氧菌多呈单个的圆形小菌落。 (1)色素：产黑色素普鲁沃菌产生黑褐色或黑色色素。龋齿放线菌产生粉红色色素。奈氏放线菌产生黄褐色色素：

(2)溶血：产气荚膜梭菌在新鲜血琼脂平板形成双溶血圈。 (3)荧光：产黑色素普鲁沃菌在紫外线灯下，显示砖红色荧光；梭杆菌常发生黄绿色荧光；艰难梭菌发生绿色荧光。

3．耐氧试验 当在厌氧平板上有菌生长时，为确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。 4．药物鉴定试验用于鉴定厌氧菌的抗生素有卡那霉素和灭滴灵。卡那霉素的敏感性叮将梭杆菌属与类杆菌属区分开，大多数类杆菌对卡那霉素耐药：灭滴灵纸片在鉴别厌氧菌(敏感)与非厌氧菌(不敏感)有重要意义。

5．聚茴香脑磺酸钠试验 厌氧消化链球菌对50g／L的聚茴香脑磺酸钠溶液敏感，而绝大多数其他G+球菌耐药。

6．生化特性鉴定 主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。为简化厌氧菌鉴定，有多种试验鉴定系统，如推测性平皿系统等。虽然不完善，但可使厌氧菌的鉴定标准化，自动化。

7．气液相色谱技术(GLC) 应用GLC分析厌氧菌的终末代谢产物，因各种厌氧菌的代谢产物不同，故已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法．可在数十分钟至数小时即可作出诊断。

8．PCR 如采用PCR方法检测抗生素相关性腹泻病人粪便中艰难梭菌的毒素基因阳性率高达82．8％，明显高于厌氧培养法的检出率19．2％，且与厌氧培养法的一致性为 100％。

9．基因探针 如用地高辛标记脆弱类杆菌的基因探针，检测标本中的脆弱类杆菌其敏感性为89％，特异性为91．7％，检测灵敏度为10pgDNA，故其特异性强，敏感性和灵敏度均高，并具有快速简便的优点。

(七)检验结果分析与报告 根据革兰染色镜检，菌落性状、耐氧试验及药敏试验若发现厌氧菌可初步报告：“检出厌氧菌，形似x x x菌”；再根据生化反应及终末代谢产物作最终报告：“分离鉴定出x x x菌”及“药物敏感试验： x x x结果”。有条件的单位可采用基因探针或PCR技术，快速准确的检测厌氧菌。

第三节厌氧球菌 在临床标本中检出的厌氧菌大约有25％为厌氧性球菌。其中G+消化球菌和消化链球菌属以及G-韦荣球菌属与临床感染相关。

—、消化球菌属 黑色消化球菌是消化球菌属中惟一的菌种。通常寄居在人的体表和与外界相通的腔道中，是人体正常菌群。在临床上可引起人体各部组织和器官的感染，常与其他细菌混合感染，如腹腔感染、肝脓肿等。

微生物特性 菌体圆形，排列成双、短链或成堆。生长缓慢，厌氧培养2～4d才形成黑色不溶血的小菌落，接触空气后颜色变浅，传代后黑色消失，通过庖肉培养后又可产生黑色素。不发酵糖，触酶阳性为其特点。对青霉素、红霉素、氯霉素、洁霉素、四环素及灭滴灵敏感。DNA的G+C为50—51mol％。

微生物检验 从感染部位采集标本，作直接涂片镜检和分离培养。接种血琼脂平板，并同时接种含血清硫乙醇酸盐培养基或庖肉培养基(增菌培养)，经厌氧培养2～4d后，观察菌落形态，革兰染色观察菌体形态和排列作出初步报告。据生化反应、抗生素纸片敏感试验以及气液相色谱分析代谢产物作出最后报告。

二、消化链球菌属 分成厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌、吲哚消化链球菌、大消化链球菌、微小消化链球菌、普氏消化链球菌、产生消化链球菌、四联消化链球菌与天芥菜春还原消化链球菌等9个菌种，其代表菌种为厌氧消化链球菌。主要依据是DNA的G+C为27-45mol％。

临床意义 以厌氧消化链球菌最常见，产生消化链球菌则很少见。消化链球菌可引起各部组织和器官感染，又以混合感染为多见，如腹腔感染、肝脓肿、外阴、阴道及盆腔感染、肺部和胸膜感染、口腔感染、颅内感染以及皮肤和软组织感染等。

厌氧消化链球菌可与金黄色葡萄球菌或溶血性 链球菌协同引起严重的创伤感染，即厌氧链球菌肌炎。该菌常可引起细菌性心内膜炎，主要由原发病灶口腔、牙周和尿道感染而引起。致菌血症较少见。在临床标本分离株中，本菌属占20％—35％，为第2位，仅次于脆弱类杆菌。

微生物特性 为G+球形或卵圆形，成双或呈短链状排列。无鞭毛。在35℃-37℃pH7-7．5时生长佳。在厌氧血平板上，菌落1mm，灰白色凸起、不透明边缘整齐，不溶血。在硫乙醇酸钠液体培养基中，呈颗粒状沉淀生长。吐温-80促进生长。触酶阴性，发酵葡萄糖不发酵乳糖，不水解胆汁七叶苷，吲哚、尿素酶、硝酸盐还原试验均为阴性，对多聚茴香磺酸钠敏感。

微生物检验 检查方法与检查黑色消化球菌基本相同。本菌培养物常有恶臭气味，为其特点。可通过形态、染色、培养特性、生化反应发酵葡萄糖产酸，分解甘露醇等与黑色消化球菌鉴别。

三、韦荣球菌 韦荣球菌属为革兰阴性厌氧球菌，有7个种，其中小韦荣球菌和产碱韦荣球菌是常见的二个种。口腔、咽部、胃肠道和女性生殖道的正常菌群，致病力不强，为条件致病菌。本属菌可产生内毒素，为脂多糖，有抗原性。

临床标本可采自软组织脓肿和血液。大多见于混合感染。临床分离率小于1％。临床标本可采自软组织脓肿和血液。大多见于混合感染。临床分离率小于1％。小韦荣球菌可引起上呼吸道感染，而产碱韦荣球菌多见于肠道感染。

微生物特性 韦荣球菌形态相似，为G-球菌，排列成对或短链，近似奈瑟球菌。无鞭毛和芽胞。专性厌氧，在血琼脂平板上发育良好，培养48h后，形成1～2mm圆形、凸起灰白色至黄色混浊菌落，不溶血。生化反应不活泼，不分解糖类，还原硝酸盐，触酶反应-／+。小韦荣球菌触酶试验阴性，而产碱韦荣球菌为阳性。

微生物检验 取临床标本作直接涂片、革兰染色、镜检。如发现Ｇ-小球菌、成对或短链或不规则排列，疑为本菌属。可用厌氧血琼脂平板分离培养，2～3d观察结果，同时可接种硫乙醇酸盐肉汤或庖肉培养基，观察生长情况与形态，并做生化反应进行鉴定。

第四节Ｇ-无芽胞厌氧杆菌 是一群不形成芽胞的厌氧杆菌，种类较多，包括类杆菌属、普雷沃菌属、紫单胞菌属和梭杆卤属等。是正常菌群，可作为条件致病菌引起内源性感染。

一、类杆菌属 是最重要的Ｇ-无芽胞厌氧杆菌，其中以脆弱类杆菌最常见，是本属代表菌株，其DNA的G+C为39-48mol％。

临床意义 类杆菌常寄生于口腔、肠道和女性生殖道，其中脆弱类杆菌占临床分离株的25％，占类杆菌分离株的50％，居临床厌氧菌分离株首位。肠道的重要菌群，为大肠埃希菌的100～1000倍。脆弱类杆菌能产生一种锌依赖金属蛋白酶或肠毒素，能使肠粘膜细胞产生病理效应。可引起女性生殖系统、胸腔及颅内感染。

微生物特性 Ｇ-着色不均，培养物涂片呈明显多形性，无鞭毛、无芽胞，多数有荚膜。专性厌氧，在厌氧血平板经24—48h培养后，菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，不溶血，加入氯化血红素、维生素K和20％胆汁可促进生长。在胆汁七叶苷(BBE)培养基中生长旺盛，菌落较大，能分解胆汁七叶苷，使培养基变黑色，菌落周围有黑晕，故BBE可作为脆弱类杆菌的选择鉴别培养基。

触酶试验阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，不发酵阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇和海藻糖，水解胆汁七叶苷，耐20％胆汁，并生长旺盛。发酵代谢产物是乙酸、丙酸和琥珀酸，一般不产生丁酸：大部分菌株对青霉素G、卡那霉素和新霉素耐药，但95％以上对氯霉素、氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素、羧塞吩青霉素、亚胺硫霉素、甲硝唑等敏感。触酶试验阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，不发酵阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇和海藻糖，水解胆汁七叶苷，耐20％胆汁，并生长旺盛。发酵代谢产物是乙酸、丙酸和琥珀酸，一般不产生丁酸：大部分菌株对青霉素G、卡那霉素和新霉素耐药，但95％以上对氯霉素、氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素、羧塞吩青霉素、亚胺硫霉素、甲硝唑等敏感。

微生物检验 标本发现Ｇ-杆菌，染色不均，具有多形性，可疑为本菌，用BBE平板分离培养37℃厌氧培养24—48h观察菌落特征。胆盐可促进生长。根据发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，水解七叶苷，耐20％胆汁等生化试验作出鉴定。气液相色谱检查其终末代谢产物，则有助于快速诊断。同时应注意与其他耐胆盐的类杆菌相鉴别。

二、普雷沃菌属 代表菌种是产黑色素普雷沃菌。寄生在口腔、女性生殖道等部位的正常菌群，仅次于脆弱类杆菌。是一种常见的条件致病菌，可引起内源性感染和混合感染，女性生殖道及口腔感染较为多见。其致病物质可能是胶原酶，与结缔组织的分解有关。

微生物特性 本群细菌的形态大同小异，涂片检查为G-球杆状，成双或短链，两端钝圆，有浓染和空泡。呈多形性。无鞭毛、芽胞和荚膜、为专性厌氧菌。在厌氧平板上生长良好，经2～3d培养后，菌落为圆形凸起、呈β-溶血。菌落初形成时为灰白色， 5～7d转为黑色。生长时需氯化血红素和维生素K，故在培养基中加入这两种物质可促进生长。

在20%胆汁培养基中绝大多数不生长，触酶阴性，除中间普雷沃菌、变黑普雷沃菌和部分洛氏普雷沃菌外脂酶均为阴性，脲酶阴性。多数对氨基青霉素、头孢菌素、卡那霉素和万古霉素耐药，而对甲硝唑霉素、利福平和新霉素敏感。在20%胆汁培养基中绝大多数不生长，触酶阴性，除中间普雷沃菌、变黑普雷沃菌和部分洛氏普雷沃菌外脂酶均为阴性，脲酶阴性。多数对氨基青霉素、头孢菌素、卡那霉素和万古霉素耐药，而对甲硝唑霉素、利福平和新霉素敏感。

第十五章厌 氧 菌