第十章 酶的作用机制和酶活性的调节

1. 第十章 酶的作用机制和酶活性的调节

2. 酶催化机理研究的主要方法 • （1）找出保守性的氨基酸残基 • （2）三维结构的研究 • （3）定点突变 • （4）动力学分析 • （5）化学修饰

3. 过渡态稳定学说 HA-HB + HC→HA-HB-HC（过渡态）→HB-HC + HA • 根据过渡态理论，在任何一个化学反应体系中，反应物需要到达一个特定的高能状态以后才能发生反应。这种不稳定的高能状态被称为过渡态。达到过渡态要求反应物必须含有足够的能量以克服活化能，然而，一个反应系统中各反应物分子具有不同的能量，只有某些反应物才含有足够的能量去进行反应。 • 1946年Pauling 提出，酶与过渡态的亲和力要比对基态（底物）的亲和力高得多，酶的催化源于其对过渡态的稳定作用。 化学反应的过渡态及 其前后的自由能变化

4. 酶促反应和非酶促反应过程的自由能变化

5. 支持过渡态稳定学说的证据 • 根据中间物的结构设计一种稳定的过渡态类似物，以检测它能否作为酶的抑制剂，以及抑制效果是不是比竞争性抑制剂强。因为如果酶促反应中的确存在所谓过渡态的中间物，那么由此人工设计得到的过渡态类似物只要遇到酶就会与活性中心紧密地结合，会牢牢地卡住酶的活性中心，使之无法完成反应，即成为酶的强抑制剂。 • 进一步证明过渡态类似物参与催化的证据是利用过渡态类似物作为抗原或半抗原，去免疫动物，由此产生的抗体可能有类似酶的催化作用。

6. 脯氨酸消旋酶的过渡态及其过渡态类似物抑制剂脯氨酸消旋酶的过渡态及其过渡态类似物抑制剂

7. 过渡态稳定的化学机制 • 与酶催化相关联的过渡态稳定是酶活性中心结构和反应性以及活性中心与结合底物之间的相互作用的必然结果。酶充分使用一系列的化学机制来实现过渡态的稳定并由此加速反应。这些机制归纳起来主要有六种机制： • （1）邻近定向效应； • （2）广义的酸碱催化； • （3）静电催化； • （4）金属催化； • （5）共价催化； • （6）底物形变。

8. 邻近定向效应 • 邻近定向效应是指两种或两种以上的底物（特别是双底物）同时结合在酶活性中心上，相互靠近（邻近），并采取正确的空间取向（定向），这样大大提高了底物的有效浓度，使分子间反应近似分子内反应从而加快了反应速度。 • 底物与活性中心的结合不仅使底物与酶催化基团或其它底物接触，而且强行“冻结”了底物的某些化学键的平动和转动，促使它们采取正确的方向，有利于键的形成。

9. 使底物靠拢 使底物分子 产生应力 使底物分子 电荷变化

10. 广义的酸碱催化 • 广义的酸碱催化是指水分子以外的分子作为质子供体或受体参与催化，这种机制参与绝大多数酶的催化。蛋白质分子上的某些侧链基团（如Asp、Glu和His）可以提供质子并将质子转移到反应的过渡态中间物而达到稳定过渡态的效果。如果一个侧链基团的pKa值接近7，那么该侧链基团就可能是最有效的广义的酸碱催化剂。蛋白质分子上的His残基的咪唑基就是这样的基团，因此它作为很多酶的催化残基。

13. 广义的酸碱催化

14. 溶菌酶Glu35的广义酸催化

15. 溶菌酶的Glu 35被疏水氨基酸残基所环绕

16. 核糖核酸酶A的广义酸碱催化

17. 静电催化 • 活性中心电荷的分布可用来稳定酶促反应的过渡态，酶使用自身带电基团去中和一个反应过渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化称为静电催化。 • 有时，酶通过与底物的静电作用将底物引入到活性中心。

18. 溶菌酶Glu35将质子交给糖苷键上的O原子以后，O因此带上正电荷，随后糖苷键断裂，左边的糖基1号位的C原子带上正电荷，邻近的Asp52的羧基本来于解离状态，带负电荷，起着中和正电荷稳定过渡态的作用。溶菌酶Glu35将质子交给糖苷键上的O原子以后，O因此带上正电荷，随后糖苷键断裂，左边的糖基1号位的C原子带上正电荷，邻近的Asp52的羧基本来于解离状态，带负电荷，起着中和正电荷稳定过渡态的作用。

19. 溶菌酶的最适pH与Glu35和Asp52的解离状态有关

20. 金属催化 • 近三分之一已知酶的活性需要金属离子的存在，这些酶分为两类，一类为金属酶，另一类为金属激活酶。前者含有紧密结合的金属离子，多数为过渡金属，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者与溶液中的金属离子松散地结合，通常是碱金属或碱土金属，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+。 • 金属离子参与的催化被称为金属催化。金属离子以5种方式参与催化：（1）作为Lewis酸起作用；（2）与底物结合，促进底物在反应中正确定向；（3）作为亲电催化剂，稳定过渡态中间物上的电荷；（4）通过价态的可逆变化，作为电子受体或电子供体参与氧化还原反应；（5）酶结构的一部分。

22. 金属离子对于某些酶分子的结构十分重要

23. 共价催化 • 共价催化是指酶在催化过程中必须与底物上的某些基团暂时形成不稳定的共价中间物的一种催化方式。许多氨基酸残基的侧链可作为共价催化剂，例如Lys、His、Cys、Asp、Glu、Ser或Thr，此外，一些辅酶或辅基也可以作为共价催化剂，例如硫胺素焦磷酸（TPP）和磷酸吡哆醛。

24. 几种酶的共价催化 亲核共价修饰反应

25. 底物形变 • 底物形变是指当酶与底物相遇时，酶分子诱导底物分子内敏感键更加敏感，产生“电子张力”发生形变，比较接近它的过渡态。

26. 底物形变

27. 溶菌酶也利用这种方式进行催化：与溶菌酶活性中心结合的6碳糖在溶菌酶的诱导下，从椅式构象变成半椅式构象而发生形变，周围的糖苷键更容易发生断裂。溶菌酶也利用这种方式进行催化：与溶菌酶活性中心结合的6碳糖在溶菌酶的诱导下，从椅式构象变成半椅式构象而发生形变，周围的糖苷键更容易发生断裂。

28. 几种常见酶的结构与功能

29. 蛋白酶 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶的总称。尽管肽键的水解在能量学上是十分有利的，但如果没有蛋白酶的催化，一个肽键在中性pH和25℃条件下大概需要300年~600年的时间才能完成水解。 根据活性中心催化基团的性质，蛋白酶可以分为四类：（1）丝氨酸蛋白酶——此类蛋白酶的催化基团包括1个不可缺少的Ser残基，DIFP是它们的不可逆抑制剂；（2）金属蛋白酶——这类蛋白酶在活性中心结合金属离子，其活性绝对需要金属离子，因此金属离子的螯合剂EDTA或邻菲罗啉的存在可导致其活性的丧失；（3）天冬氨酸蛋白酶——其催化基团包括两个重要的Asp，在偏碱性的pH下无活性；（4）巯基蛋白酶——其催化基团包括1个Cys的巯基，巯基试剂为它们的不可逆抑制剂。 所有蛋白酶在催化过程中都经历四面体的过渡态，该过渡态形成的原因是反应涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。如果是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，进攻的亲核基团分别是Ser残基的羟基和Cys残基的巯基，否则就是水分子。丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的催化机理中包括共价催化，脂酰基酶是酶与底物的共价中间物，而金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶催化的反应更为直接，没有共价催化。

30. 丝氨酸蛋白酶 这一类蛋白酶以一个特定的Ser残基作为必需的催化基团，属于该家族成员的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶和组织型纤溶酶原激活剂。 丝氨酸蛋白酶的催化机制属于共价催化和广义酸碱催化的混合体，由三个不变的氨基酸残基构成的催化三元体（Ser、His和Asp）起主导作用，这三个氨基酸残基任何一种突变或修饰（例如，Ser被DIPF修饰）均可导致酶活性的丧失。　　　 虽然各种丝氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但构成催化三元体的三个氨基酸残基在肽链中的位置并不完全相同。然而，酶学家已达成共识，将这三个氨基酸残基总是进行一样的编号，即His57、Asp102和Ser195。它们在催化中的具体功能是：（1）Ser195充当进攻底物的亲核基团；（2）His57作为广义的酸碱催化剂；（3）Asp102 的功能仅仅是定向His57，影响His的pKa，改变其酸碱性质。

31. 胰蛋白酶具有很深的底物结合口袋，而口袋的底部又是Asp，特别适合长的碱性氨基酸侧链（Lys和Arg）的结合；糜蛋白酶的底物结合口袋没有胰蛋白酶深，但比它宽，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特别适合芳香族氨基酸的结合；弹性蛋白酶的底物结合口袋非常浅，最适合结合侧链较小的氨基酸残基。胰蛋白酶具有很深的底物结合口袋，而口袋的底部又是Asp，特别适合长的碱性氨基酸侧链（Lys和Arg）的结合；糜蛋白酶的底物结合口袋没有胰蛋白酶深，但比它宽，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特别适合芳香族氨基酸的结合；弹性蛋白酶的底物结合口袋非常浅，最适合结合侧链较小的氨基酸残基。

32. 丝氨酸蛋白酶的催化三元体

33. 底物与活性中心的Ser195和Gly193残基通过氢键形成ES复合物，疏水口袋正好容纳芳香环；底物与活性中心的Ser195和Gly193残基通过氢键形成ES复合物，疏水口袋正好容纳芳香环；

34. 亲核的Ser195残基进攻羰基碳，形成第一个四面体形的过渡态中间物；亲核的Ser195残基进攻羰基碳，形成第一个四面体形的过渡态中间物； 活性中心的三个氨基酸残基依次参与此阶段的反应，构成催化三元体结构：His57从Ser195移去一个质子，致使Ser195的亲核性大增，而His57成为带正电荷的共轭酸。Asp102通过氢键结合，稳定上述过渡态，而肽键骨架上的酰胺键也通过与His57形成氢键而得以稳定。

35. 四面体中间物因肽氧负离子与Ser195以及Gly193之间形成的氢键而得到稳定，这些相互作用的净效应导致活化能的降低。

36. 肽键断裂，离开基团（原来肽键的氨基一侧作为第一产物）从His57咪唑环上得到一个质子。原来肽键的羧基一侧通过氢键以及与Ser195形成的共价键仍然与酶结合。

37. 水进入活性中心，质子化His57使之成为酸。而释放出来的OH-亲核进攻留下来的多肽羰基碳，于是第二个四面体形的过渡态中间物形成了。

38. Ser195从His57重新得到质子，His57仍然与它通过氢键相连，过渡态中间物瓦解，脂酰化酶中间物被水解，残留的多肽部分（第二产物）被释放。

39. 糜蛋白酶催化的四 面体中间物的形成 糜蛋白酶催化形成的 四面体中间物的稳定

40. 酶活性的调节机制

41. 酶需要在正确的时间和正确的地点有活性 不合适的表达或激活导致细胞的癌变或死亡！

42. 如何控制特定的生化反应? 控制已有的酶的活性 控制酶浓度 控制酶的位置 控制底物的可得性 产物的移除或转化

43. 酶的“量变”和“质变”的比较

44. 酶的“量变” 改变酶量的方式有两种，一种是通过同工酶，另外一种是通过控制酶基因的表达和酶分子的降解。

45. 同工酶(isozyme) 同工酶是指催化相同的反应但性质不同（Vmax和/或Km不同）的酶。它们可能以不同的量出现在一种动物不同的组织或器官，也可能出现在任何真核生物细胞不同的细胞器。例如，高等动物的乳酸脱氢酶（LDH）有五种形式—M4、M3H、M2H2、MH3和M4。M4由四个M亚基组成，主要存在于骨骼肌，H4由四个H亚基组成，主要存在于心脏。

46. 乳酸脱氢酶催化的酶促反应

47. What is an isozyme?(1) Isozymes are physically distinct forms of the same enzyme.(2) Isozymes may differ from each other by differences in their amino acid sequences or by the presence of different posttranslational modifications in each isozyme. (3) The relative abundance of different isozymes varies for different tissues. The ability to control which isozymes are expressed in a particular cell allows each cell to adjust the enzyme activity based on the specific conditions that exist in the cell.

48. Isozymes: An automotive analogy

49. Lactate Dehydrogenase is composed of four monomers Each monomer can be either heart or muscle type Five different isozymes of lactate dehydrogenase exist: H4, H3M, H2M2, HM3, and M4

50. Each isozyme of lactate dehydrogenase can be separated by chromatography Different tissues have different levels of each of the lactate dehydrogenase isozymes During myocardial infarction, endothelial cells rupture, releasing their contents into the bloodstream. This increases the serum levels for lactate dehydrogenase isozymes 1 and 2 and can be used as a diagnostic tool. + -