实验十二 微生物数量的测定

1. 实验十二 微生物数量的测定

2. 微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。 • 测定微生物数量的主要方法： 显微镜直接计数法（不辨死活） 平板菌落计数法（形成菌落的微生物） P32 光电比浊法（不用于颜色太深的样品） 测定细胞重量法（测定丝状真菌生长量） 测定细胞总氮量或总碳量（适于浓度较高的样品） 。。。。。。

3. 显微镜直接计数法 目的要求 • 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法； • 掌握显微镜下直接计数的技能。

4. 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 直接计数法优缺点 • 优点：直观、快速、操作简单。 • 缺点： • 不能区分死菌与活菌，所得为总数； • 不适于对运动细菌的计数。

5. 常用计菌器 • 常用计数器有血球计数板(血细胞计数板)、Petroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等。 • 各种计数板的计数原理相同，只是血球计数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直接计数细菌。

6. 血球计数板 Petroff-Hauser计菌器 Hawksley计菌器

7. 计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。 每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。 • 血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网。 • 无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。

8. 计数方法 • 使用血球计数板计数时，通常数5个中方格的总菌数A，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（计数室）中方格的数量(25或16)，就得出一个大方格中的总菌数，再换算成每毫升菌液中微生物细胞的数量。 • 计算： • 1mL菌液中总菌数=A/5*25*104*B=50000*A*B • 1mL菌液中总菌数=A/5*16*104*B=32000*A*B 其中B为稀释倍数。

9. 注意事项 • 对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。 • 对于压线酵母，按照数上不数下、数左不数右的原则计数

10. 实验器材 活材料： 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养液。 其他器材： 显微镜、血球计数板、电吹风、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。

11. 实验方法 清洗时切勿用刷子等硬物， 也不可用酒精灯火焰烘烤 1、用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液（以每个小方格中5～10个菌为宜）。 2、取洁净的血球计数板一块（事先镜检），盖上一块盖玻片。 3、将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘摘入一小滴，让菌悬液利用毛细渗透作用充满计数区。 4、加样后静止5min，将计数板置显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数。（光不宜太强） 5、计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，用电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。 6.作业：结果（填表） P55 取样时要摇匀菌液，加样是 计数室不可有气泡产生 清洗时切勿用刷子等硬物， 也不可用酒精灯火焰烘烤

12. 光电比浊计数法 目的要求 • 了解光电比浊计数法的原理。 • 学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

13. 基本原理 • 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。 • 在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度-菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。

14. 光电比浊计数法优缺点 • 优点：简便、快速、连续测定、适合自动化。 • 缺点： • 光密度受细胞大小、形态、培养液成分以及选用的波长的影响； • 对于不同微生物的菌悬液要选择相应的菌株和培养条件制作标准曲线； • 对于颜色太深的样品或含其它具有吸光值的物质不能用此法。

15. 器材 • 菌种 酿酒酵母培养液 • 仪器或其他用具 分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。

16. 标准曲线的制作 样品测定 操作步骤 光密度值 每毫升细胞数

17. 1、血球计数板直接计数：首先采用血球计数直接计数酿酒酵母菌悬液。（ 2×108菌/mL ） 2、稀释菌液：将上述已知浓度的酿酒酵母菌悬液用无菌生理盐水分别稀释成为（依次2倍稀释）：1×108、 5×107、 2.5×107、 1.25×107、 6.25×106、 3.125×106菌/mL的菌悬液。 3、测OD值：以无菌生理盐水作为对照，于波长560nm处用1cm比色杯测定上述各菌液的OD值。 4、以OD值为纵坐标，每毫升菌数为横坐标，绘制标准曲线。 标准曲线的制作

18. 样品测定 1、稀释样品：将待测菌悬液用无菌生理盐水适当稀释。 2、在560nm波长用1cm比色皿测定稀释后菌悬液的光密度。 3、计算：根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数，乘以稀释倍数就得到原液中细菌数。

19. 721型分光光度计操作方法 • 接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10至15分钟。 • 将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档）。根据所需波长转动波长选择钮。 • 将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。 • 在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向T=0处。 • 盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的T=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。 • 比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。

20. 平板菌落计数法 目的要求 掌握平板菌落计数的的原理和方法 每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）= 每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数

21. 操作步骤 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 振荡10min 制备土壤稀释液→ 倾注平板→ 培养→ 计数 称取10g土样 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 90ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 0.1ml 10-1 0.1ml 0.1ml 20ml 20ml 20ml 倒培养基 2× 每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）= 每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数

22. 注意事项 • 注意控制培养基温度 • 一般选择每个平板上有50-200个菌落的稀释度来计算每毫升的含菌量较为合适 • 同意稀释度重复平板不能少于3个 • 一般连续三个稀释度中的第二个稀释度在平板上出现的菌落在50个左右，否则要加以调整 • 连续三个稀释度计算出CFU(每毫升样品中的菌落形成单位数)不应相差太大