Białka w diagnostyce laboratoryjnej

1. Białka w diagnostyce laboratoryjnej Stelmach Justyna Gr. A2 III OAM

2. Rola białek osocza: • Kontrola dystrybucji płynów przestrzeni pozakomórkowej • Funkcje transportowe • Regulatory enzymów • Białka odpornościowe • Ciśnienie onkotyczne • Funkcja odżywcza

3. Proteinogram • Albuminy 60-70% • Alfa-1 globuliny 2-4% • Alfa-2 globuliny 4-7% • Beta globuliny 8-13% • Gamma globuliny 9-22% Całkowite stężenie białka w osoczu 60-80 g/l Wydalane z moczem= 20-80mg/dobę

4. Za krytyczne uznaje się poziomy białka całkowitego poniżej 45g/l i albuminy poniżej 20g/l. Przy takich stężeniach ciśnienie onkotyczne jest bardzo niskie, dochodzi do ucieczki wody poza naczynia, powstawania obrzęków i przesięków do jam ciała.

5. Białka specyficzne: • Albuminy- ciśnienie onkotyczne (80%) • Alfa1-antytrypsyna-inhibitor proteaz • Beta2-mikroglubulina- podjednostka układu HLA • Ceruloplazmina- białko wiążące miedź i enzym • Białko C-reaktywne (CRP)- wskaźnik stanu zapalnego • Transferyna- białko transportujące żelazo • Ferrytyna- białko transportujące żelazo w tkankach • Haptoglobina- białko wiążące hemoglobinę • SHBG-Glubulina wiążąca hormony płciowe- wiąże testosteron • TBG-Globulina wiążąca hormony tarczycy • Transkobalamina- wiąże wit.B12

6. Paraproteiny • immunoglobuliny produkowane przez pojedynczy klon komórek linii limfocytów B (np. plazmocyty) • zazwyczaj występuje w obrębie globulin gamma • paraproteiny pojawiają się najczęściej w przebiegu szpiczaka mnogiego, plazmocytom i choroby Waldemstrom’a (makroglobulinemia-IgM) • elektroforeza białek osocza jest podstawowym badaniem wykrywającym paraproteiny ale mocz powinien być także badany • w przebiegu szpiczaka wydzielane są tylko immunoglobuliny zbudowane z łańcuchów lekkich, które są wykrywane w 75% przypadków w moczu jako białko Bence-Jones’a

7. Synteza i degradacja białek osocza: • Dwie duże pule białek: • albumina-czynnikiem regulującym jej syntezę w wątrobie jest ciśnienie onkotyczne działające poprzez onkoreceptory łożyska naczyniowego • immunoglobuliny-syntetyzowane w limfocytach w wyniku ich aktywacji przez różne antygeny. • Degradacja ATP-niezależna w lizosomach (białka nieuszkodzone, „długo żyjące”). • Degradacja ATP-zależna w cytosolu (białka nieprawidłowe, „krótko żyjące”). • Okres półtrwania białek (czas wymagany do zmniejszenia stężenia białka do 50% wartości początkowej): • czynnik VIII krzepnięcia: kilka godzin • albumina: czternaście dni • immunoglobuliny: dwadzieścia cztery dni • Białka osocza nie gromadzą się w wątrobie, prawie cała pula białek znajduje się w przestrzeni międzykomórkowej, tylko 40% jest w naczyniach, pozostałe 60% w przestrzeni pozanaczyniowej. • Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy od równowagi miedzy syntezą a degradacją dwóch, głównych frakcji białkowych: albuminy i immunoglobulin. • Większość białek jest katabolizowana w wątrobie lub komórkach śródbłonka naczyń.

8. Hipoproteinemia: • Obniżenie poziomu białek w wyniku: a) zwiększonej utraty białek b) zahamowania ich syntezy w wątrobie c) rozcieńczenia przez nadmiar lub zmiany dystrybucji wody pozakomórkowej. • Niedobory immunoglobulin • Zmiany objętości przestrzeni pozakomórkowej: • przewodnienia • spadek ciśnienia krwi • stany zapalne

9. Przyczyny: • Zespoły utraty białka: • nerkowe (kłębkowe zapalenie nerek, cukrzyca, toczeń rumieniowaty trzewny, zakrzepica żył nerkowych) • jelitowo/żołądkowe (stany zapalne, nowotwory złośliwe, zwężenie, uchyłki, choroba popromienna, niewydolność krążenia, zapalenie krezki) • skórne (rozległe oparzenia, dermatozy) • wysięki (obrzęki, zapalenia płuc, wodobrzusze) • krwotoki • stany ciężkie (urazy, nowotwory, sepsa) • Zahamowanie syntezy białek w wątrobie: • uszkodzenie miąższu wątroby (toksyczne, marskość, zanik miąższu, pierwotny lub wtórny nowotwór) • zaburzenia wchłaniania (zespoły poresekcyjne, biegunki bakteryjne, zakażenia, mukowiscydoza) • niedobory białka w diecie (niedożywienie)

10. Ocena niedoborów białek osocza • Niskie poziomy białka całkowitego i albuminy mogą poza leczeniem ich przyczyny, wymagać uzupełniania ich niedoboru, a szczególnie gdy są poniżej poziomów krytycznych. • Podczas uzupełniania niedoborów należy uwzględnić również wielkość dobową ujemnego bilansu białkowego. Skuteczność tego typu leczenia należy monitorować przez oznaczanie poziomu białka całkowitego i albuminy.

11. Hiperproteinemie • Prawdziwa hiperproteinemia jest spowodowana znacznym wzrostem produkcji jednej lub wielu klas immunoglobulin. • Zwiększeniu stężenia immunoglobulin często towarzyszy obniżenie poziomu albuminy. • Stężenie białka całkowitego może być w granicach normy lub obniżone, nawet przy znacznej hipergammaglobulinemii (w póżnych stadiach marskości wątroby, w rozwoju zespołu nerczycowego w przebiegu chorób kolagenowych). • Przyczyny hiperproteinemii • Hipergammaglobulinemie: • monoklonalne (szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenströma, choroba ciężkich łańcuchów) • poliklonalne (przewlekłe stany zapalne, choroby autoimmunologiczne) • przewlekłe choroby wątroby (marskość, wirusowe zapalenia, sarkoidoza) • odwodnienia

12. Dysproteinemia •  to nie prawidłowe proporcje białka we krwi, przy prawidłowym poziomie białka całkowitego

13. Szybkość opadania krwinek czerwonych (Odczyn Biernackiego,OB). • Test oceny zaburzeń proporcji między stężeniami poszczególnych białek osocza i właściwości erytrocytów. • W próbie krwi pobranej z antykoagulantem (cytrynian sodu) krwinki czerwone opadają w wyniku większego ciężaru właściwego (1.095g/l) niż osocze (1.027g/l).

15. Szybkość OB. Jest wypadkową składu osocza oraz właściwości erytrocytów. Zwiększenie stężenia fibrynogenu, białek frakcji globulinowych alfa i beta (białka ostrej fazy), oraz spadek poziomu albuminy powodują wzrost OB. • Mała ilość erytrocytów w niedokrwistościach jest przyczyną ich szybszego opadania.

16. Elektroforeza białek surowicy

17. Elekroforeza (bibułowa, na agarozie, na octanie celulozy, w żelu skrobiowym i żelu poliakylamidowym)polega na wędrówce oznaczonych ładunkiem elektrycznym cząstek białkowych w roztworze elektrolitu podczas przepływu stałego prądu elektrycznego • szybkość wędrówki zależy od ruchliwości w polu elektrycznym, a ta zależy od wielkości cząstek i wielkości ładunku powierzchniowego • Białka, których zmiana stężeń może wpłynąć na obraz elektroforetyczny surowicy to:a) frakcja albuminowa (53-68%)b) frakcja α 1-globulinowa (1-4%)c) frakcja α2- globulinowa (1-14%)d) frakcja β globulinowa (8-17% razem z beta2)e) frakcja gamma-globulinowa (9-22%)

18. Immunoelektroforeza białek surowicy ludzkiej •  to połączenie rozdziału elektroforetycznego i immunoprecypitacji białek, przy zastosowaniu specyficznych reakcji precypitacji antygen-przeciwciało, jest często wykorzystywana w rozpoznawaniu paraproteinemii. Identyfikacja nieprawidłowych białek po rozdziale elektroforetycznym jest możliwa, jeśli zastosuje się surowice odpornościową. W wyniku reakcji antygen (antygenem jest w tym przypadku rozdzielone elektroforetycznie białko) z przeciwciałami znajdującymi się w surowicy odpornościowej wytwarzają się linie precypitacyjne, które umożliwiają identyfikację nieprawidłowego białka.Charakterystyczne zmiany zawartości jednej lub kilku frakcji białkowych stwierdza się w wielu chorobach.

19. CHROMATOGRAFIA • (bibułowa, jonowo wymienna, cienkowarstwowa) wykorzystuje różnice szybkości wędrówki składników białkowych w ośrodkach porowatych.

20. Białka płynu mózgowo-rdzeniowego: mają skład podobny do białek osoczowych •  zaliczamy do nich: prealbuminy, albuminy, α 1- i 2- , β-, gamma- globuliny  • stężenie białek w płynie mózgowo-rdzeniowym jest ok. 100 razy mniejsze i wynosi 0,15-0,45 g/l

21. Elektroforeza białek PMR • Cechy charakterystyczne: prealbumina, białko tau (związane z mikrotubulami neuronów, odpowiada za ich stabilizacje oraz wiązanie z neurofilamentami i organellami komórkowymi) Brak fibrynogenu.

22. Albumina • Syntetyzowana w wątrobie, ok.15g/dobę. • Czas połowicznego trwania (T1/2) 14 dni. • Nieswoisty transporter bilirubiny, hormonów, witamin, wapnia, magnezu, kwasów tłuszczowych, leków oraz substancji wchłoniętych w jelitach i transportowanych do wątroby. • Bisalbuminemia – występowanie dwóch rodzajów albumin o różnym składzie aminokwasowym i różnej mobilności elektroforetycznej.

23. Immunoglobuliny: • Immunoglobuliny (przeciwciała) mają zdolność swoistego łączenia się z antygenem i są najważniejszymi cząsteczkami układu odpornościowego. • Syntetyzowane przez limfocyty B. • Na podstawie różnic w budowie łańcuchów ciężkich (α,δ,ε,γ,μ) wyróżniamy odpowiednio pięć klas: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

24. Hipogammaglobulinemia • Pierwotna – uwarunkowana genetycznieraczej rzadko spotykana, może dotyczyć wszystkich lub jednej klasy Ig. • Wtórna – związana z chorobą (nowotwory, leczenie cytostatykami, usunięcie śledziony). Bardzo niskie poziomy immunoglobulin związane są najczęściej z ubytkiem limfocytów B.

25. Hipergammaglobulinemia • Hipergammaglobulinemiapoliklonalna – jest to prawidłowa odpowiedź organizmu na infekcję bakteryjną lub wirusową. W pierwszym etapie infekcji następuje wzrost stężenia IgM, po dwóch tygodniach IgG oraz stopniowy zanik IgM. • Podwyższony poziom IgA jest często związany z infekcjami błon śluzowych (S-IgA wytwarzane miejscowo przez komórki plazmatyczne błon śluzowych mają zdolność neutralizowania wirusów i wiekszą efektywność aglutynacji bakterii). • Hipergammaglobulinemia monoklonalna – wzrost immunoglobulin produkowanych przez nadmiernie rozrastającą się linię limfocytów (grupa chorób nowotworowych limfocytów B). • Przyczyny: szpiczaki, makroglobulinemia Waldenströma, chłoniaki i łagodne gammapatie monoklonalne.

26. Białka ostrej fazy • Synteza w wątrobie pod wpływem cytokin zapalnych w przebiegu zakażeń bakteryjnych, martwicy tkanek, ostrych i przewlekłych stanów zapalnych, chorób zakaźnych, nowotworów.Część nieswoistej odpowiedzi immunologicznej. • Rola- modulowanie odczynu zapalnego i ochrona tkanek nieobjętych stanem zapalnym przed niszczącym działaniem proteinaz i silnych oksydantów wydzielanych przez fagocyty.

27. Niewielki ↑: • Choroby nowotworowe • Niedożywienie • Ciąża • Menstruacja • Zespół metaboliczny • Opsoniny, inhibitory proteinaz, chelatory metali, transportery hormonów, białka wiążące hem i hemoglobinę, białka układu krzepnięcia (fibrynogen i antyplazmina III) oraz białka układu dopełniacza.

28. Ujemne białka ostrej fazy: • Albumina • Transferryna • Prealbumina Dodatnie białka ostrej fazy: • fibrynogen • α1- antytrypsyna (AAT) • ceruloplazmina • haptoglobina (HP) • białko C-reaktywne (CRP) • surowicze amyloidowe białko A (SAA) • laktoferryna • białka układu dopełniacza

29. Białko C-reaktywne • Znaczny wzrost obserwowany jest w pierwszej dobie uszkodzenia tkanek (zawał mięśnia sercowego, białaczek, w odrzucie przeszczepów, zakażeniach bakteryjnych). • Prawidłowe stężenie CRP w surowicy jest mniejsze niż 5 mg/l. • hsCRP - test o wysokiej czułości: 0.2 mg/l; pozwala na zmierzenie bardzo małych wartości CRP z dużą precyzją w zakresie decyzyjnym. • Wyniki ostatnich badań wskazują, że stężenie CRP posiada znaczenie prognostyczne w chorobie sercowo-naczyniowej. Procesy zapalne odgrywają bardzo ważną rolę w patogenezie miażdżycy, a stopień podwyższenia poziomu CRP, który jest charakterystyczny dla przewlekłego stanu zapalnego, jest czynnikiem oceniającym ryzyko wystąpienia zawału mięśnia sercowego lub udaru mózgu. • Poziom CRP powyżej 2.1 mg/l jest związany z trzykrotnym zwiększeniem ryzyka wystąpienia zawału mięśnia sercowego oraz dwukrotnym zwiększeniem ryzyka wystąpienia udaru mózgu.

30. Metody ilościowego oznaczania białek: • Metoda Lowry’ego • Metoda Bradforda • Metoda mikrobiuretowa • Metoda pomiaru absorbancji w UV • Metoda z kwasem Bis-cynchoninowym (BCA) • Metoda Kiejdahla • Metoda biuretowa • Metoda kolorymetryczna z odczynnikiem Nesslera

31. Metoda Kiejdahla • Metoda referencyjna, oznaczanie azotu, Zasada: • Zawartość azotu w różnych białkach jest względnie stała i wynosi ok. 16%. • Znając odsetek azotu w badanej próbie, można obliczyć, ile zawiera białka.

32. Metoda kolorymetryczna z odczynnikiemNesslera • Żółtozielony roztwór jodku rtęciowo-potasowego przechodzi w czerwony jodek amidooksyrtęciowy. Pomiar absorbancji 490-510 nm • Zalety: duża specyficzność da wszystkich białek • Wady: duża pracochłonność

33. Metoda biuretowa Zasada oznaczenia: • Oznaczanie natężenia barwy powstałej w wyniku utworzenia związków kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym λ =530 nm • Zalety:Wysoka specyficzność dla wszystkich białek • Wady: niska czułość (10mg/l). • Materiał: Surowica, mocz (w zaawansowanej nerczycy)

34. Metoda mikrobiuretowa: Modyfikacja metody biuretowej • Mechanizm podobny, ale zastosowana długość fali 310 nm zwiększa ok 10 x jej czułość • Każdą próbę wykonuje się w dwóch szeregach: biały (B) i niebieski (N) • Szereg biały zawiera roztwór białka + 30% NaOH, szereg niebieski roztwór białka + CuSO4 w 30% NaOH • Właściwą absorbancję do obliczeń otrzymuje się z różnicy N-B. Zalety: wysoka specyficzność w stosunku do wszystkich białek. Wady: duże zużycie roztworu białka (dwa szeregi)

35. Metoda Lowry’ego • Zasada: dwie odrębne reakcje: reakcja aminokwasów z odczynnikiem Folina reakcja biuretowa. • Zalety:bardzo wysoka czułość reakcji (1mg/l) • Wady: mała specyficzność. • Materiał : Mocz, PMR.

36. Metoda Bradforda • W metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego - CoomassieBrilliantBlue G-250 (CBB G250) z grupami aminowymi białek. • λ=595 nm • Zalety: • prostota i szybkość oznaczenia • duża czułość (0,5mg/l) • oznaczenia można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, związków tiolowych, sacharozy, glicerolu

37. Metoda pomiaru absorbancji w UV • Wartość wsp. absorpcji zależy od % zawartości aminokwasów aromatycznych i dla białek osocza o stężeniu 1 mg/ml wynosi od 0,8 do 1,6 • Obecność kwasów nukleinowych w badanym materiale przeszkadza w oznaczeniu (max absorbcji 260 nm) • Wady: • Mała specyficzność • Metoda nadaje się do oznaczania stężenia oczyszczonego białka (na podstawie znanego wsp. absorpcji)

38. Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA) • W alkalicznym środowisku niektóre składniki białek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+ • Cu1+ tworzą barwny kompleksowy związek z kwasem biscynchoninowym(BCA) • λ=540 –580 nm

39. Białka markery

40. Markery zawału mięśnia secowego • Markery prognostyczne: Hs-CRP- high sensitive-C-Reactive Protein (wysoko czułe białko C-reaktywne) MPO- mieloperoksydaza CD-40 • Markery destabilizacji blaszki miażdżycowej PAPP-A- Pregnancy-Associated Protein-A (ciążowe białko osoczowe A) • Markery niedokrwienia IMA (ACB)- Ischemia Modifed Albumin (AlbuminCobaltBinding) Albumina modyfikowana niedokrwieniem (wiązanie kobaltu przez albuminę)

41. Markery martwicy komórkowej Mioglobina (niespecyficzny) H-FABP- Hart-FattyAcidBinding Protein (sercowe białko wiążące kwasy tłuszczowe) CK-MB Troponiny sercowe (cardiac)- cTnT, cTnI • Marker niewydolności serca Peptydy natriuretyczne (Natriureticpeptides)- ANP-przedsionkowy (atrial) (typ A); BNP- mózgowy (brain) (typ B); NT-proBNP

42. Markery filtracji kłębkowej (nerkowej): • Beta-2 mikroglobulina- jest niskocząsteczkowym białkiem (11.8kDa) obecnym na błonie komórkowej prawie wszystkich komórek jądrzastych (także limfocytów). Beta-2-M jest małą podjednostką antygenu zgodności tkankowej (HLA). Nerka jest głównym miejscem eliminacji beta-2-M gdzie jest filtrowana w kłębuszkach i w 99.9% reabsorbowana w kanalikach proksymalnych. • cystatyna C- jest kationowym polipeptydem o masie cząsteczkowej 13kDa. Ponieważ podlega stałej i równomiernej produkcji i ulega całkowitej filtracji w kłębuszkach nerkowych, cystatna-C jest endogennym markerem filtracji (GFR) lepszym niż beta-2-M i kreatynina.

43. SHBG • SteroiHormonsBinding Globulin (globulina wiążąca hormony sterydowe)- oznaczenie SHBG jest polecane w przypadku konieczności wyjaśnienia niskiego lub wysokiego stężenia testosteronu, gdy wolny (biologicznie aktywny) testosteron jest w normie