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III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de febrero de 2009. La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN). Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe. HPN Definición.

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III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia

Castellón, 27 de febrero de 2009

La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

Amparo Sempere

Servicio de Hematología

H.U. La Fe

hpn definici n
HPNDefinición
  • Enfermedad clonal adquirida de la célula hematopoyética pluripotencial
  • Mutación somática en el gen PIG-A (fosfatidil-inositol-glucano de clase A) implicado en la síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GPI)
    • Carencia total o parcial de la expresión de proteínas ancladas a la membrana a través del componente GPI en parte de la células hematopoyéticas
hpn alteraci n gen tica gen pig a
HPNAlteración genética: Gen PIG-A

Bloqueo en la HPN

  • Uno de los más de 20 genes implicados en la síntesis de las proteínas ancladas a GPI
  • Se encuentran mutaciones del gen PIG-A en todos los casos en que se ha interrumpido la síntesis de GPI
  • Como consecuencia de la mutación se reduce o falta la expresión de proteínas ancladas a la superficie de la célula por moléculas de GPI

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

hpn prote nas ancladas a gpi
HPNProteínas ancladas a GPI
  • Enzimas: acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina granulocítica
  • Moléculas de adhesión: CD48, CD58, CD66b-c
  • Proteínas reguladoras del complemento:
    • CD55: factor que acelera la degradación de las convertasas del complemento (DAF)
    • CD59: inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MIRL)
  • Receptores: CD14, CD16, CD87, CD90
  • Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios
  • Antígenos del neutrófilo
  • Otros: CD24, CD52

Hernández-Campo et al. Med Clin. 2008; 131: 617-630

distribuci n de las prote nas ancladas a gpi
Distribución de las proteínas ancladas a GPI

CD55

CD58

CD59

PrPC

AChE

JMH Ag

Dombroch

HG Ag

Células B

CD24CD55

CD58CD59

CD48 PrPC CD73 CD108

Células progenitoras

hematopoyéticas

Hematíes

CD55 CD58*

CD59 CD48

CD52 CD87

CD108 PrPc

ADP-RT CD73

CD90 CD109

CD16*

Células T

CD55

CD58

CD59

CD109

PrPC

GP500

Gova/b

Plaquetas

CD59, CD90, CD109

Células NK

CD55 CD58*

CD59 CD14

CD16 CD24

CD48 CD66b

CD66c CD87

CD109 CD157

LAPNB1 PrPC

p50-80 GPI-80

ADP-RT NA1/NA2

Monocitos

CD55

CD58

CD59 CD48

CD52

PrPc

CD16

(Cortesía de Lucio Luzzatto)

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

PMN

CD14 CD55 CD58*

CD59 CD48 CD52

CD87 CD109 CD157

Grupo 8 PrPC GPI-80

CD16

d ficit de prote nas gpi hem lisis intravascular
Déficit de proteínas GPI: hemólisis intravascular
  • La reducción o ausencia de CD55 y CD59 en la superficie de los eritrocitos los hace muy vulnerables a la acción del complemento y provoca su destrucción
  • CD55 (DAF): previene la formación de complejos C3-C5-convertasa esenciales para la amplificación de la secuencia de activación de las proteínas del sistema de complemento
  • CD59 (MIRL): inhibe la formación del complejo de proteínas del sistema del complemento C5b-C9 de ataque de membrana
  • Déficit de CD59: formación de poros en la membrana y muerte celular
hpn cascada del complemento

CD59

CD59

Complejo de

ataque a la

membrana

HPNCascada del Complemento

Vía alternativa

Vía clásica

CD59

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

hpn tipos de hemat es seg n sensibilidad al complemento
HPNTipos de hematíes según sensibilidad al complemento
  • HPN tipo I: sensibilidad normal a la acción del complemento
  • HPN tipo II: sensibilidad intermedia (3-5 veces superior a la normal). Déficit parcial de CD59
  • HPN tipo III: sensibilidad elevada (15-25 veces superior a la normal). Déficit total de CD59

Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 736-748

Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 749-757

hpn incidencia y prevalencia
HPNIncidencia y prevalencia
  • Enfermedad rara, pero grave
  • Incidencia: 1,3 casos por 1.000.000 habitantes y año
  • Prevalencia: 7-16 casos por 1.000.000 habitantes
  • Afecta igual a hombres y mujeres

Hill A et al. Blood 2006; 108: A985

hpn historia natural11
HPNHistoria Natural
  • Amplio espectro de manifestaciones clínicas
  • Mediana de edad al diagnóstico  40 años
  • Mortalidad atribuible  50% (trombosis y citopenias)
    • La trombosis es la principal causa de mortalidad y de morbilidad
  • Mediana de supervivencia: 10-25 años
  • Remisión espontánea: 15%
hpn cl nica
HPN Clínica

Anemia aplásica

Trombosis

Hemoglobinuria

  • Hemólisis intravascular– síntomas 1
    • dolor abdominal
    • disfagia
    • disfunción eréctil
    • letargia
  • Trombosis2,3
  • - hepática, cerebral
  •  50%
  • de pacientes
  • Insuficiencia medular
  • puede preceder a la HPN4,5

1. Rother et al. JAMA 2005;293:1653-627. 2. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M et al. N Engl J Med 1995;333:1253-8. 3. Socie G, Mary JY, Gramont A et al. Lancet 1996;348:573-7. 4. Wang et al. Blood 2002;100:3897–902. 5. Dunn et al. Ann Int Med 1999;131:401–8.

hpn clasificaci n
HPNClasificación
  • HPN clásica: hemólisis intravascular, % elevado de granulocitos deficientes en proteínas GPI y una población mayoritaria de hematíes tipo III. Sin otra enfermedad medular asociada
  • HPN asociada a otras hemopatías: hemólisis intravascular en el contexto de otra enfermedad medular como AA y SMD
  • HPN subclínica: sin evidencia clínica ni analítica de hemólisis. Mediante citometría de flujo se detectan pequeños clones de células de HPN. Asociación frecuente con insuficiencia medular (AA y SMD)

Parker C et al. Blood 2005;106:3699-709

hpn sintom tica o molecular
¿HPN sintomática o molecular?
  • Mosaicismo: células progenitoras normales y patológicas
  • Enfermos con pequeños clones raramente tendrán síntomas relacionados con la HPN
  • En pacientes con clones de granulocitos HPN < 10% la clínica de hemólisis será mínima o nula (AA y anemia refractaria)
  • Un clon de granulocitos HPN superior a 50%: mayor riesgo de trombosis
  • El tamaño del clon puede variar con el tiempo y un 15% de enfermos con HPN hemolítica pueden tener remisión espontánea
  • El tratamiento va a depender, en gran medida, de la presentación clínica y del tamaño del clon HPN
hpn tratamiento
HPNTratamiento
  • Sintomático (transfusiones, anticoagulación oral, corticoides, ácido fólico, hierro,…)
  • Trasplante de progenitores hematopoyéticos: único tratamiento curativo
  • Eculizumab (anti-C5): nuevo tratamiento específico de la HPN (Registro Internacional de HPN)
eculizumab anticuerpo anti c5
Eculizumab: Anticuerpo anti-C5

Human framework regions

CH1

Hinge

CL

Complementarity determining regions(murine origin)

CH2

Human IgG4 heavy chain

constant regions 2 and 3

Human IgG2 heavy chain

constant region 1 and hinge

CH3

Rother et al. Nature Biotech 2007;25:1265–73

hpn cascada del complemento17

Eculizumab

CD59

CD59

Complejo de

ataque a la

membrana

HPNCascada del Complemento

Vía alternativa

Vía clásica

CD59

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

hpn qui n deber a ser estudiado
HPN¿Quién debería ser estudiado?
  • Hemoglobinuria
  • Hemólisis intravascular no inmune (Coombs negativo, LDH elevada) especialmente si ferropenia
  • Trombosis de localización infrecuente: síndrome de Budd-Chiari, venas abdominales, cerebrales o dérmicas
  • Anemia aplásica
  • SMD: Anemia refractaria
  • Disfagia o dolor abdominal y hemólisis intravascular
  • Citopenias mantenidas de origen desconocido

Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

hpn evaluaci n inicial
HPNEvaluación inicial
  • Estimar el grado de hemólisis: hemograma, reticulocitos, LDH sérica, bilirrubina fraccionada y haptoglobina
  • Determinar el grado de insuficiencia medular: aspirado y biopsia de médula ósea y citogenética
  • Establecer el déficit de proteínas asociadas a GPI: detección de poblaciones de células de sangre periférica (hematíes, neutrófilos y monocitos) deficientes en antígenos asociados a grupos GPI

Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

hpn m todos diagn sticos
HPNMétodos Diagnósticos
  • Pruebas clásicas: aumento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento
  • Citometría de flujo (CMF): ausencia de proteínas asociadas a grupos GPI
  • Análisis molecular: secuenciación e identificación de mutaciones del gen PIG-A
hpn pruebas cl sicas
HPNPruebas Clásicas

Pruebas de Ham-Dacie y de sacarosa

  • Técnicas laboriosas
  • Difícil estandarización
  • Restringidas a hematíes
  • Falsos negativos (especialmente en pacientes transfundidos)
  • Requiere un 5% de células tipo III (déficit total) o un 20% de tipo II (déficit parcial) para dar resultados positivos
  • Interés histórico
slide22

Suero fresco acidificado inactivado por calor

Suero fresco acidificado + magnesio

Suero

fresco

Suero fresco acidificado

Salino + hematíes

Control de sacarosa

Sacarosa

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

hpn an lisis molecular
HPNAnálisis Molecular
  • Secuenciación del gen PIG-A
  • No aplicable como técnica de rutina
  • Laboratorios de investigación
hpn citometr a de flujo
HPNCitometría de Flujo
  • Nicholson-Weller, 1985: aplicación de la CMF al diagnóstico de la HPN
  • Van der Schoot, 1990: superioridad de la CMF sobre la prueba de Ham
  • Hall & Rose, 1996: CMF como método de elección
  • Brodsky, 1999, 2000: método diagnóstico alternativo, proaerolisina conjugada con fluoresceína (FLAER, de fluorescein-labelled AERolysin)

Vidriales M. B. Haematologica (ed. esp.) 2008; 93 (Supl.2); 9-11

citometr a de flujo ventajas
Citometría de FlujoVentajas
  • Rapidez (1 hora)
  • Sensibilidad (clones <1%)
  • Marcaje múltiparamétrico: con tres anticuerpos la sensibilidad puede llegar a 0,01%
  • Análisis de diferentes líneas celulares
  • Detección de clones de hematíes tipo I/II/III
  • Cuantificación y monitorización del tamaño del clon HPN
hpn citometr a de flujo26
HPNCitometría de Flujo
  • El análisis por citometría de flujo es el método de elección para el diagnóstico y seguimiento de la HPN
citometr a de flujo c lulas
Citometría de FlujoCélulas

Analizar un mínimo de dos líneas celulares:

  • Hematíes
  • Neutrófilos y monocitos
  • Linfocitos: discrepancias en el tamaño clonal respecto a los neutrófilos
  • Plaquetas: expresión débil y variable de proteínas GPI en controles sanos
citometr a de flujo tama o del clon hpn
Citometría de Flujo Tamaño del clon HPN
  • Tamaño del clon de hematíes

- Tipos de hematíes: I/II/III

- Proporción de hematíes HPN en relación a la última transfusión

  • Tamaño del clon de neutrófilos: refleja mejor el tamaño del clon HPN
  • Tamaño del clon de monocitos: valida el tamaño del clon HPN (puede tener discrepancias con los neutrófilos)
citometr a de flujo estudio de h emat es
Citometría de FlujoEstudio de hematíes
  • Análisis multiparamétrico con marcaje directo
  • Adquisición con SSC/FSC en escala logarítmica
  • Estudio de dos antígenos GPI diferentes: CD55 y CD59 (permite descartar deficiencias congénitas aisladas)
  • Incluir un AcMo frente a un antígeno eritroide no asociado a GPI para seleccionar los hematíes (CD235a)
  • CD59: discrimina hematíes tipo I, II y III
  • Las transfusiones afectan el tamaño del clon de hematíes (realizar estudio tras un mínimo de un mes desde la última transfusión)
  • El estudio puede realizarse hasta 2 semanas tras la extracción de la muestra (mantener los hematíes a 4º C)
  • Incubación mínima de 15 min y un solo lavado
  • Incluir un control de sangre normal
hemat es an lisis multiparam trico
Hematíes: análisis multiparamétrico

Combinación

CD59 FITC/CD55PE/CD235a PE-Cy5

Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

cd59 identificaci n y c uantificaci n de clones hpn
CD59: Identificación y cuantificación de clones HPN

PNH

Count

CD59 FITC-A

Tipo I: células con expresión normal de CD59

Tipo II: células con deficiencia parcial de CD59

Tipo III: células con deficiencia completa de CD59

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

hpn cl sica hemat es
HPN clásica: hematíes

Control

Control

HPN clásica

Tipo III

HPN clásica

Tipo II

Tipo I

hpn cd59 hemat es
HPN CD59: hematíes

<1%

HPN subclínica

HPN AA

12,2%

Tipo II

84%

Control

HPN clásica

Tipo I

Tipo III

citometr a de flujo estudio de l eucocitos
Citometría de FlujoEstudio de leucocitos
  • El análisis en granulocitos es superior al de hematíes para establecer el tamaño del clon HPN
  • El estudio debe ser multiparamétrico lo que permite detectar de forma simultánea la deficiencia de antígenos GPI e identificar clones de HPN de pequeño tamaño
  • Es muy importante la selección de los AcMo contra antígenos GPI (alta expresión en células normales, específicos de una línea celular, baja afinidad por uniones inespecíficas y combinables en un marcaje múltiple)
  • Es recomendable utilizar AcMo no asociados a GPI para seleccionar la población diana
  • La técnica de FLAER permite detectar pequeños clones HPN
citometr a de flujo neutr filos y monocitos
Citometría de FlujoNeutrófilos y monocitos
  • Sangre periférica en EDTA (<24 horas)
  • Análisis multiparamétrico con marcaje directo
  • Neutrófilos: CD16, CD24, CD55, CD59 y CD66b
  • Monocitos: CD14, CD52, CD55, CD59
  • Selección de la población: CD15, CD33
  • Se debe valorar la presencia de formas inmaduras y displasia (citología/CMF).
  • Adquisición de 100.000 eventos
  • Incluir un control normal de forma paralela
  • CD55 y CD59: lisar y marcar
  • Análisis inicial de neutrófilos y monocitos (CD16/CD14), si compatible con HPN analizar hematíes
estrategia de an lisis neutr filos y monocitos
Estrategia de análisis: neutrófilos y monocitos

P1+P3 = granulocitos

P2+P4 = monocitos

Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

neutr filos cd16
Neutrófilos: CD16

Control

HPN Subclínica

HPN Clásica

neutr filos cd55
Neutrófilos: CD55

HPN AA 3,5%

Control

HPN clásica: 92%

neutr filos cd5539
Neutrófilos: CD55

HPN subclínica: 1,2%

HPN AA: 6,5%

HPN clásica: 92%

Control

monocitos cd14
Monocitos: CD14

HPN AA: 7%

Control

HPN clásica: 93%

monocitos cd55
Monocitos: CD55

HPN AA: 6%

HPN clásica: 93%

Control

citometr a de flujo flaer
Citometría de FlujoFLAER
  • La aerolisina es una toxina secretada por la Aeromonas hydrophila, que produce hemólisis mediante la unión a la molécula GPI
  • La proaerosilina es una variante inactiva de la proteína bacteriana que está conjugada con fluoresceína (FLAER) y que mantiene la capacidad de unión a GPI sin causar lisis
  • Restringida a leucocitos, permite la identificación y cuantificación de pequeños clones de HPN (<0,02%)
  • Puede utilizarse sola o en combinación con más anticuerpos dirigidos frente antígenos GPI
  • Permite el análisis de pacientes con SMD

Brodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756.

Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

citometr a de flujo flaer43

FLAER Alexa 488

Citometría de Flujo FLAER

Células normales

Células normales

Células HPN

Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

flaer an lisis de los clones
FLAER: análisis de los clones

HPN

HPN

Clon de granulocitos HPN = 8,9%

Clon de monocitos HPN = 8,1%

FLAER/ CD24 /CD16 /CD33/CD15/CD14

Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

hpn cmf seguimiento
HPNCMF: Seguimiento
  • El seguimiento y la monitorización del clon de HPN es esencial en el manejo clínico del enfermo
  • En los enfermos en tratamiento con eculizumab aumenta el clon de hematíes y se iguala al de neutrófilos en unos 6 meses de media
  • Monitorizar el clon de granulocítos es importante por el riesgo de trombosis
  • En HPN subclínica se recomienda controlar el tamaño del clon tras iniciar tratamiento con inmunosupresores
  • El tamaño del clon puede variar con el tiempo y pacientes con un clon de HPN estable y de tamaño intermedio peden tener una remisión espontánea

Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

citometr a de flujo seguimiento del clon hpn
Citometría de Flujo Seguimiento del clon HPN

Controles mínimos (Registro Internacional de HPN):

  • Pacientes con HPN clásica sin eculizumab y en HPN asociada o subclínica: anual
  • Enfermos con HPN con eculizumab: al inicio del tratamiento, a los 6 meses y después anual
  • Reevaluación si cambios clínicos

Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

seguimiento clon de hemat es con eculizumab
SeguimientoClon de hematíes con eculizumab

HPN clásica: 60% diagnóstico

Células control

HPN clásica: 95% 1 año con eculizumab

seguimiento clon de neutr filos con eculizumab
SeguimientoClon de neutrófilos con eculizumab

HPN clásica: 94%, diagnóstico

Células control

HPN clásica: 98%, 1 año con eculizumab

hpn cmf temas pendientes
HPN CMF: Temas pendientes
  • El Registro Internacional de HPN requiere que los datos aportados sean lo más homogéneos posible
  • El uso de diferentes técnicas complica la estandarización de los resultados
  • No se dispone de criterios inmunofenotípicos validados para el diagnóstico de HPN
  • Falta de consenso en la estrategia de análisis y en la selección de los anticuerpos
  • Necesidad de reuniones de consenso
citometr a de flujo reuni n de consenso
Citometría de FlujoReunión de Consenso
  • Objetivo principal: intentar llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN por CMF, para tratar de disminuir, en lo posible, las diferencias técnicas e intentar homogeneizar los resultados entre distintos laboratorios

Madrid, 27 de enero 2009

citometria de flujo reuni n de consenso
Citometria de Flujo: Reunión de Consenso
  • Deben analizarse al menos dos líneas celulares con al menos dos antígenos asociados a GPI
  • Marcaje multiparamétrico
  • Se recomienda el estudio de neutrófilos y hematíes
  • Cálculo del tamaño del clon

Granulocitos: CD16, CD66, CD24 o CD55

Hematíes: CD59 o CD55/CD59 en marcaje combinado

Monocitos: CD14 y CD55

  • En el estudio de HPN subclínica, se recomiendan técnicas de CMF de alta resolución y llegar a una sensibilidad de 0,1%
  • Realizar el estudio de hematíes y leucocitos de forma independiente
  • Necesidad de disponer de un control de calidad externo

Madrid, 27 de enero 2009

slide52

III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia

Castellón, 27 de febrero de 2009

La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

Amparo Sempere

Servicio de Hematología

H.U. La Fe