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各位老师好！

各位老师好！. 结直肠癌 c-erbB-2 、 CD44 v6 及 nm23 表达 与临床病理特征及预后的相关性研究 硕士研究生 张 建 兵 导 师 陈莉教授. 引言.

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  1. 各位老师好！

  2. 结直肠癌c-erbB-2、CD44v6及nm23表达 与临床病理特征及预后的相关性研究 硕士研究生 张 建 兵 导 师 陈莉教授

  3. 引言

  4. 肿瘤的复发和转移是当今肿瘤治疗最棘手的问题之一。据统计，有90%以上的癌症病人死于肿瘤的复发或转移。研究肿瘤细胞转移的分子基础及其与癌基因及抑癌基因的关系，已成为目前肿瘤防治研究的热点问题。真核细胞增殖调控是一个多因素、多环节、涉及到细胞内众多分子事件的复杂过程。在细胞增殖调控中，大多数癌基因是促进与发挥正调作用，而抑癌基因则是抑制与负调作用。它们在正常细胞中可能有调节细胞正常生长、抑制肿瘤形成的作用，它们的失活或缺失会导致细胞增殖失控或癌变。肿瘤的复发和转移是当今肿瘤治疗最棘手的问题之一。据统计，有90%以上的癌症病人死于肿瘤的复发或转移。研究肿瘤细胞转移的分子基础及其与癌基因及抑癌基因的关系，已成为目前肿瘤防治研究的热点问题。真核细胞增殖调控是一个多因素、多环节、涉及到细胞内众多分子事件的复杂过程。在细胞增殖调控中，大多数癌基因是促进与发挥正调作用，而抑癌基因则是抑制与负调作用。它们在正常细胞中可能有调节细胞正常生长、抑制肿瘤形成的作用，它们的失活或缺失会导致细胞增殖失控或癌变。

  5. 癌基因c-erbB-2又称为neu 或 HER-2。c-erbB-2编码分子量为185ku 的穿膜蛋白，与表皮生长因子受体（EGFR）同源，该蛋白可以抑制酪氨酸激酶活性，c-erbB-2过度表达和扩增可见于多种肿瘤。已有很多研究表明，乳腺癌c-erbB-2的高水平表达常常与较大的原发瘤体积、较多的腋下淋巴结转移及较差的内分泌治疗反应性有关，预示着更早、更多的术后复发及较短的生存期｛1，2｝。

  6. 粘附分子CD44是淋巴细胞的一种归巢受体，为高度异质性的单链跨膜糖蛋白，参与细胞与细胞间、细胞与基质间的粘连，有标准型（CD44s）和变异型（CD44V）两型。据报道，其变异体CD44v6 过表达与结直肠癌的侵袭能力有关｛3，4｝。

  7. 核苷二磷酸激酶（NDPK/ nm23）属NME基因家族，被认为参与了同恶性肿瘤转移相关的多种调节活动。nm23异常改变一方面可引起微管聚合而成的纺锤体异常，导致非整倍体形成；另一方面可通过细胞骨架及细胞素等信号反应性的改变引起细胞运动，从而参与侵袭和转移过程。研究发现啮齿动物实验性肿瘤的转移能力与nm23基因的表达呈密切负相关｛5｝，Bertheau 等｛6｝在甲状腺恶性肿瘤中研究证实nm23及基因产物的表达与肿瘤的转移和预后相关密集，nm23的mRNA 下调与肿瘤的淋巴结转移和低生存率有关。

  8. 结直肠癌（colorectal carcinoma）是人类常见恶性肿瘤之一，对人类的健康构成了极大威胁。近年来对结直肠癌相关基因产物的检测已逐步和早期诊断、发病机制、病理特征、估计预后等密切联系起来，但研究结果不尽一致[7-10]。目前分子病理学研究认为，结直肠癌的发生是个多阶段、多因素作用的过程，主要是由于癌基因激活、抑癌基因及DNA修复基因突变或功能缺失所致。我们应用免疫组织化学方法同时检测结直肠癌中癌基因蛋白c-erbB-2、CD44v6及nm23的表达，并探讨其与病理特征和临床预后的相关性。

  9. 材料和方法

  10. 1.1材料 1.1.1临床资料： 92例结直肠癌： 28例：有十年以上随访结果 64例：无随访结果 以上病例均为结直肠原发性腺癌，不含腺瘤癌变的病例，都只作了结直肠癌根治手术，未作化疗、放疗等辅助治疗。男性49例，女性43例，年龄24～75岁（中位55岁）。结肠癌27例，直肠癌65例。根据国际抗癌联盟（UICC）的TNM分期标准[11]（见表1）作临床分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期28例，Ⅲ期37例，Ⅳ期8例。

  11. 表1 UICC结直肠癌TNM分期标准 •  A.    TNM定义分期 描述 原发肿瘤（T）Tx 原发肿瘤资料不详 T0 原发灶不能确定 Tis 原位癌 T1 肿瘤侵入粘膜下层 T2 肿瘤侵入肌层 . T3 肿瘤穿过肌层到浆膜下或至无腹膜的结肠周围或直肠周围组织 T4 肿瘤穿过脏层腹膜或直接侵入其它器官组织

  12. 表1 UICC结直肠癌分期 •  A.  TNM定义分期 描述 区域淋巴结（N） Nx 区域淋巴结资料不详 No 无淋巴结转移 N1 肿瘤转移至1—3个结肠（直肠）周围淋巴结 N2 肿瘤转移至≥4个结肠（直肠）周围淋巴结 N3 肿瘤转移至主要血管沿途的任何淋巴结

  13. 表1 UICC结直肠癌分期 •  A.  TNM定义分期 描述 远处转移（M） Mx 不能确定有无转移 M0 无远处转移 M1 有远处转移

  14. 表1 UICC结直肠癌分期 •  B.分期标准 期别 T N M 0 Tis N0 M0 Ⅰ T1 ,T2 N0 M0 Ⅱ T3,T4Ｎ0Ｍ0 Ⅲ　　 Ａny Ｔ　　Ｎ1,Ｎ2,Ｎ3Ｍ0 ⅣＡny Ｔ　 Ａny Ｎ Ｍ1

  15. 1.1.2病理资料： 92例结直肠癌中，高分化腺癌16例，中分化腺癌45例，低分化腺癌21例，粘液腺癌10例。对全部病例观察了镜下肿瘤生长方式（推进式为主34例，图1；浸润性为主58例，图2）以及瘤周淋巴样细胞聚集情况（21例见有大量淋巴样细胞浸润，图3；71例无大量淋巴样细胞浸润，图2）。

  16. 1.1.3主要试剂及实验材料： c-erbB-2 单克隆抗体（克隆系TAB250），工作浓度1：100；CD44v6单克隆抗体（克隆系2F10）, 工作浓度1：100；nm23单克隆抗体（克隆系M-0421），工作浓度1：80。抗原修复液为0.01M、PH6.0 枸橼酸盐缓冲液，DAB显色。以上试剂、二抗及SP试剂盒均为DAKO公司产品。免疫标记阳性对照组织来自乳腺癌、胃癌。

  17. 1.2 方法 1. 2.1 标本及玻片的处理： 所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，3～4μm连续切片。每例选取四张切片贴于经多聚赖氨酸处理的玻片上，70 oC烘烤2小时，1张进行HE染色，其余3张进行免疫组织化学染色。

  18. 1.2.2 HE染色： • 主要步骤： 石蜡切片 脱蜡 梯度乙醇水化 苏木素染色 盐酸乙醇分化 返蓝 伊红染色 梯度乙醇脱水 透明 封固

  19. 1.2.3 c-erbB-2、CD44v6及 nm23免疫组织化学染色： • 主要步骤： • 石腊切片脱蜡至水 去内源性酶 • 抗原修复（高压锅煮沸放气3分钟,nm23不需） 一抗 二抗 SP复合物 DAB显色 水洗，苏木素复染，封片。

  20. 1.1.2.4 免疫组织化学检测结果分析方法： c-erbB-2、CD44v6 阳性定位在细胞膜出现棕黄色颗粒，nm23阳性定位在细胞浆出现棕黄色颗粒。着色细胞＜10%为阴性，＞10%为阳性。

  21. 1.2.5 统计学处理方法： • 运用Stata 7.0统计软件（美国计算机资源中心研制）进行统计学处理。不同组间表达率的比较采用Fisher精确检验；对有随访结果的病例用Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析，并对有预后意义的指标作出Kaplan-Meier生存曲线。

  22. 结果

  23. 2.1 结直肠癌癌基因蛋白表达与临床病理参数的关系 92例结直肠癌中，44例c-erbB-2阳性（图4、5），阳性率47.8%；51例CD44v6阳性（图6、7），阳性率55.4%；39例nm23阳性（图8、9），阳性率42.4%。c-erbB-2、CD44v6及nm23表达与组织分型、UICC分期、肿瘤生长方式及瘤周淋巴样细胞浸润的关系见表2。

  24. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N C-erbB-2 • 阴性阳性阳性率% • 组织类型 • 高分化腺癌 16 10 6 37.5 • 中分化腺癌 45 23 22 48.9 • 低分化腺癌 21 9 12 57.1 • 粘液腺癌 10 6 4 40.0 • p=0.658

  25. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N CD44V6 • 阴性阳性阳性率% • 组织类型 • 高分化腺癌 16 8 8 50.0 • 中分化腺癌 45 21 24 53.3 • 低分化腺癌 21 7 14 66.7 • 粘液腺癌 10 5 5 50.0 • p=0.696

  26. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N nm23 • 阴性阳性阳性率% • 组织类型 • 高分化腺癌 16 9 7 43.8 • 中分化腺癌 45 27 18 40.0 • 低分化腺癌 21 13 8 38.1 • 粘液腺癌 10 4 6 60.0 • p=0.690

  27. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N C-erbB-2 • 阴性阳性阳性率% • UICC分期 • Ⅰ、Ⅱ期47 31 16 34.0 • Ⅲ期37 15 22 59.5 • Ⅳ期8 2 6 75.0 • p=0.018*

  28. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N CD44V6 • 阴性阳性阳性率% • UICC分期 • Ⅰ、Ⅱ期47 28 19 40.4 • Ⅲ期37 10 27 73.0 • Ⅳ期8 3 5 62.5 • p=0.009**

  29. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N nm23 • 阴性阳性阳性率% • UICC分期 • Ⅰ、Ⅱ期47 29 18 38.3 • Ⅲ期37 18 19 51.4 • Ⅳ期8 6 2 25.0 • p=0.300

  30. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N C-erbB-2 • 阴性阳性阳性率% • 肿瘤生长方式 • 推进式为主 34 21 13 38.2 • 浸润性为主 58 27 31 53.4 • p=0.197

  31. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N CD44V6 • 阴性阳性阳性率% • 肿瘤生长方式 • 推进式为主 34 17 17 50.0 • 浸润性为主 58 24 34 58.6 • p=0.516

  32. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N nm23 • 阴性阳性阳性率% • 肿瘤生长方式 • 推进式为主 34 23 11 32.4 • 浸润性为主 58 30 28 48.3 • p=0.190

  33. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N C-erbB-2 • 阴性阳性阳性率% • 瘤周淋巴样细胞浸润 • 有大量淋巴样细胞浸润 • 21 16 5 23.8 • 无大量淋巴样细胞浸润 • 71 32 39 54.9 • p=0.014*

  34. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N CD44V6 • 阴性阳性阳性率% • 瘤周淋巴样细胞浸润 • 有大量淋巴样细胞浸润 • 21 13 8 38.1 • 无大量淋巴样细胞浸润 • 71 28 43 60.6 • p=0.084

  35. 表2 C-erbB-2、CD44v6、nm23表达与结直肠癌临床病理参数的关系 • N nm23 • 阴性阳性阳性率% • 瘤周淋巴样细胞浸润 • 有大量淋巴样细胞浸润 • 21 11 10 47.6 • 无大量淋巴样细胞浸润 • 71 42 29 40.8 • p=0.622 • 注：p为Fisher精确检验值 * 示P＜0.05 **示P＜0.01

  36. 由表2可见，c-erbB-2表达与UICC分期及瘤周淋巴样细胞浸润有关（P＜0.05），而与组织分型及肿瘤生长方式无明显关系。CD44v6表达与UICC分期有关（P＜0.01），而与其余参数无关。nm23表达与上述各项参数间均无明显关系。由表2可见，c-erbB-2表达与UICC分期及瘤周淋巴样细胞浸润有关（P＜0.05），而与组织分型及肿瘤生长方式无明显关系。CD44v6表达与UICC分期有关（P＜0.01），而与其余参数无关。nm23表达与上述各项参数间均无明显关系。

  37. 2.2 结直肠癌的单因素和多因素生存关系分析 随访十年以上的28例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表达与随访结果见表3。

  38. 表3 28例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表达与生存资料 • 生存时间（例） ＜5年（%） 5—10年（%）＞10年（%） • 组织类型 • 高、中分化腺癌（20） 3(15.0) 10(50.0) 7(35.0) • 低分化、粘液 腺癌（8） 6(75.0) 2(25.0) 0 • UICC分期 • Ⅰ、Ⅱ期（17） 2(11.8) 8(47.0) 7(41.2)   • Ⅲ、Ⅳ期（11） 7(63.6) 4(36.4) 0   • 肿瘤生长方式 • 推进式（10） 2(20.0) 3(30.0) 5(50.0)   • 浸润性（18） 7(38.9) 9(50.0) 2(11.1)

  39. 表3 28例结直肠癌临床病理特征、癌基因蛋白表达与生存资料 • 生存时间（例） ＜5年（%） 5—10年（%） ＞10年（%） • 瘤周淋巴样细胞浸润 • 有大量淋巴样细胞（6） 0 2(33.3) 4(66.7)   • 无大量淋巴样细胞（22 9(40.9) 10(45.5) 3(13.6)   • c-erbB-2   • －(16) 2(12.5) 7(43.75) 7(43.75)   • ＋(12) 7(58.3) 5(41.7) 0   • CD44v6   • －(14) 4(28.6) 3 (21.4) 7(50.0)   • ＋(14) 5(35.7) 9(64.3) 0   • nm23 • －(15) 7(46.7) 7(46.7) 1(6.6)   • ＋(13) 2(15.4) 5(38.5) 6(46.1)  

  40. 对表3进行单因素Cox模型分析，结果见表4。

  41. 表4. 结直肠癌单因素生存分析(Cox比例风险模型)结果 • 风险比 标准误 z统计量 P值 95％可信区间 • 组织分型4.316485 2.070272 3.05 0.002 1.686075 11.05054 • UICC分期6.15839 3.069948 3.65 0.000 2.318166 16.36025 肿瘤生长方式3.236392 1.677992 2.27 0.023 1.171477 8.941054 瘤周淋巴样细胞浸润 • 5.977281 4.484426 2.38 0.017 1.373706 26.00839 • c-erbB-2 5.519218 2.756547 3.42 0.001 2.073714 14.68947 • CD44v6 2.576888 1.232054 1.98 0.048 1.009535 6.577633 • nm23 .2552479 .1230412 -2.83 0.005 .0992302 .6565691

  42. 由表4可见，结直肠癌组织分型、 UICC分期、肿瘤生长方式、瘤周大量淋巴样细胞浸润及c-erbB-2、CD44v6、nm23表达均与预后有关（P＜0.05）。

  43. 对表3进行多因素Cox模型分析结果见表5 • 表5. 结直肠癌多因素生存分析(Cox比例风险模型)结果 • 风险比 标准误 z统计量 P值 95％可信区间 UICC分期10.88877 6.41264 4.05 0.000 3.433109 34.53587 c-erbB-2 5.724749 3.212325 3.11 0.002 1.905997 17.19454 nm23 .3072231 .1580824 -2.29 0.022 .1120639 .8422513

  44. 由表5可见，只有UICC分期、c-erbB-2和nm23表达具有独立的预后意义（P＜0.05），即UICCⅢ、Ⅳ期，c-erbB-2过表达及nm23表达减少与结直肠癌的不良预后有关（图1a-3a）。由表5可见，只有UICC分期、c-erbB-2和nm23表达具有独立的预后意义（P＜0.05），即UICCⅢ、Ⅳ期，c-erbB-2过表达及nm23表达减少与结直肠癌的不良预后有关（图1a-3a）。

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