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Etiología y diagnóstico de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles de los animales. Laboratorio de Referencia para EET de los Animales Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agrícolas - INTA Castelar.

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Etiología y diagnóstico de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles de los animales

Laboratorio de Referencia para EET de los Animales

Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agrícolas - INTA Castelar

“Cursos de capacitación y actualización para la prevención y vigilancia de EETs”

slide3

Hipótesis sobre el origen

  • Scrapie
  • Garrapatas, organoclorados????
  • Enfermedad espontánea????
  • Origen exótico????
  • Origen humano???? (Colchester & Colchester Lancet. 366, 856; 2005).

?

  • Scrapie
slide4

Scrapie: enfermedad genética?

Ovino: gen Sip sA/sA 150-200 días

sA/pA 300 días

pA/pA

PRNP

1936: Transmisión experimental de Scrapie

slide6

Características del agente de EET

-Hay cepas

-Barrera de la especie

-Tamaño similar a virus

-No hay respuesta de anticuerpos

-Resistencia (calor, radiaciones, nucleasas)

-Sensibilidad parcial a proteasas

-Ácido nucleico?

(tiempo de incubación, lesiones SNC)

slide7

Modelo de agente de TSE

Debe explicar

-Falta de respuesta de anticuerpos

-Existencia de cepas (tiempo de incubación, lesiones)

-Barrera de la especie (transmisión estocástica)

slide8

Inactivación del agente de EEB

Calor húmedo

121 ºC, 1 atm, 20 min Incompleta

133 ºC, 3 bar, 20 min

Calor seco

138 ªC Incompleta

Métodos químicos

Hidróxido de Sodio 1N, 24 hs

Hidróxido de Sodio 2N, 2 hs

Hipoclorito de Sodio 12 hs

slide9

Agentes hipotéticos de "Scrapie"

  • Virus

Lentos

No convencionales

  • "Virino“
  • Agentes no convencionales
  • PRIONES

Hipotéticos

slide10

Alper et al., BBRC 22: 278 (1966)

Pattison & Jones, Vet Rec 80: 2 (1967)

Griffith, Nature 215: 1043 (1967)

Merz et al., Acta Neuropathol 54: 63 (1981)

SAF: Scrapie Associated Fibrils

slide11

Priones

“Pequeñas partículas proteináceas que resisten la inactivación por métodos que modifican ácidos nucleicos”

PrP

PrPC: proteína normal del huesped

PrPSc: proteína patogénica de Scrapie

Stanley B. Prusiner. Science 216: 136-144, 1982

slide12

Isoformas de PrP

Proteinasa K

Detergente

-

Normal PrPC(33-35 kD)

Asociada a

enfermedadPrPSc(33-35 kD)

PrP27-30(27-30 kD)

+

-

+

slide13

Isoformas PrPC y PrPSc

C

Sc

PrP

PrP

Detergentes

soluble

insoluble

Proteasas

sensible

resistente

(PrP27-30)

-hélice (%)

30

42

3

43

(%)

hoja

slide14

Modelo de nucleación-polimerización

(Equilibrio entre las dos isoformas)

PrPC PrPSc

Incorporación de monóméros PrPSc (rápida)

Núcleo infeccioso

Nucleación

(muy lenta)

Estructura

amiloide

Fragmentación

en núcleos infecciosos

slide15

Encefalopatías Espongiformes

Transmisibles

Tiempo de incubación Años

Diagnóstico preclínico No

Prevención No

Signos clínicos Neurológicos

Tratamiento No

Cura No

Evolución Rápida

Desenlace Fatal

Diagnóstico definitivo Post mortem

PrP

slide16

NH

COOH

Prusiner, Science 278: 245 (1997)

?

slide17

Polimorfismos en PrP animales

Scrapie:

95% QQ171

Ovino

Caprino

171

108

136

142

154

189

86

Q

L

A

H

T

I

Octapéptidos

R

R

V

M

F

V

H

Bovino

Murino

ELW/00

slide19

136 141 154 171

  • Valina (V) Fenilalanina (F) Arginina (R) Arginina (R)
  • Alanina (A) Leucina (L) Histidina (H) Glutamina (Q)
    • Histidina (H)

Polimorfismo del gen PRNP

slide22

P C R

PCR - ELISA

Secuenciación

Manual o Automática

Determinación de genotipos

PCR - RFLP

slide26

Cepas de Scrapie

  • 20 definidas por pasaje en ratón

- Nor 98: aislada de casos de campo:

Definida por:

- Clínica

- Histopatología

- “R” en 171: susceptible

slide27

2) Francia: Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004

3) Japón??

Cepas de BSE

1: Italia

BASE: Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy

Casalone et al. Proc Natl Acad Sci 101:3065, 2004

slide28

“Molecular analysis of ovine prion protein identifies similarities

between BSE and an experimental isolate of natural scrapie,

CH1641”. Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999

“Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases”

Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004

solamente en el post mortem
Solamente en el post mortem
  • “Test del tercer párpado” (in vivo) para “scrapie”
slide31

-Histopatología

-Detección de PrP:

Inmunohistoquímica

SAF Western Blot ELISA

slide32

Histopatología

(Lesión espongiforme)

Inmunohistoquímica

(Depósitos de PrP)

slide33

En ovinos

SAF: Scrapie Associated Fibrils

slide34

Medula Oblongata (Región del Obex)

1) Médula espinal

2) Cerebro

3) Región del Obex

4) Area utilizada para WB/ELISA

5) Muestra de elección

slide35

Tests rápidos

BSE

-Prionics Check Western

-Prionics LIA

-TeSeE (BioRad)

-CDI InPro

- CediTect BSE Test

- Enfer TSE Kit version 2.0, automated sample preparation

- IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA

- Institut Pourquier Speed´it BSE

- Prionics Check PrioSTRIP

- Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit

- Roche Applied Science PrionScreen

      • Scrapie
      • - IDEXX Herdchek
  • - InPro CDI-5
slide36

Métodos de referencia:

-Histopatología

-Inmunohistoquímica

-Western blot

Métodos utilizados en el Programa de Vigilancia de Argentina

  • Test rápidos:
  • -Western blot (Prionics)
  • - Enfer TSE (ensayo piloto-2003)
slide37

Algunos métodos en estudio (in vivo)

  • Detección de PrPSc en sangre

(Scherr et al.,J. Chromat697: 223, 1997)

  • Unión de PrPSc a plasminógeno en soporte sólido

(Fischer et al., Nature 408: 479, 2000)

  • Detección de PrPSc en orina (Shaked et al., J Biol Chem 276: 31479, 2001)
  • “Protein misfolding cyclic amplification”

(Saborio et al. Nature 411: 810, 2001)

  • Detección de secuencias cortas de ADN asociadas a EET en sangre

( Schütz et al, Clin Diagn Lab Inmunol. 12 (7): 814-820, 2005)

slide38

Laboratorio de referencia para el diagnóstico de EET de animales

B. J. Carrillo

F.J. Blanco Viera

E. L. Weber

M. Alegre

F. Capellino

F. Delgado

S. Duffy

D. Funes

L. Jiménez

E. León

A. Marcos

S. Martínez

G. Pinto

C. Soto

C. Vallejos

C.Hirschvogel

A. Marcos

G. Figueroa

S. Carceller

A. Elisei

Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas

Castelar