Лекция 8 . РНК-редактирование

1. Лекция 8. РНК-редактирование Понятие о РНК-редактировании Редактирование митохондриальной мРНК кинетопластных простейших Эдитинг митохондриальной мРНК плесневого гриба Physarum polycephalum Эдитинг митохондриальных мРНК растений Редактирование структурных РНК Эдитинг хлоропластных мРНК растений Происхождение и эволюция РНК-редактирования

2. Этапы крушения центральной догмымолекулярной генетики ДНК иРНК БЕЛОК 50-60-ые гг ДНК иРНК БЕЛОК 70-ые гг Обратная транскрипция Сплайсинг, процессинг 80-ые гг. ДНК пре иРНК РНК БЕЛОК РНК-эдитинг 90-ые гг. (1986)

3. В 1986 году изменения последовательностейинформационной РНК (мРНК), ведущие к модификации ДНК-кодируемой информации, были обнаружены в митохондриях паразитических простейших – трипаносом В мРНК наблюдались вставки или (реже) делецииуридиновых нуклеотидов Эти вставки приводили к изменению информационного контекста по сравнению с закодированным в ДНК-молекуле Такая "правка" ДНК матриц на уровне мРНК получила название РНК-редактирование (RNA-editing)

4. Митохондриальная ДНК трипаносом и других кинетопластных простейших, называемаякинетопластной ДНК, состоит из комплекса больших и малых колец Приблизительно 50 сцепленных максиколец размером 23-36 тпн содержат структурные и рРНК гены и несколько специальных генов РНК-проводников (guide-РНК) От 5 до 10000 сцепленных миниколец кодируют все остальные guide-РНК. Количество различных генов РНК-проводников в клетках видоспецифично,их бывает до 300.

5. Из 20 генов мтДНК трипаносом 12 редактируются

6. РНК-проводники являются комплементарными – "антисмысловыми" к участкам редактируемых мРНК Они способны образовывать короткие "якорные" дуплексы с пре-редактируемой РНК вблизи участка эдитинга

7. Вставки и делеции уридиновых (U) нуклеотидов, обычно в кодирующие районы mRNA транскриптов митохондриального генома трипаносом

8. мРНК перед эдитингом 4 3 2 1 GCGGAGAAAAAAGAAAGGGUCUUUUAAUG 5' AAA (N) 3' : : : 3‘ UUUUUUUUUU CAGAAAAUUAC 5' РНК- OHU Aпроводник U C(quide RNA) A A Поли-UCUЯкорь конецU A U U ЭДИТИНГ Отредактированная мРНК 4 3 2 1 5' GCGGAGAAAAAAUGAAAUGUGUUGUCUUUUAAUG AAA 3' 3' UUUUUUUUUUUUUACUUUAUACAACAGAAAAUUAC5' OH Guide RNA : Предполагаемая структура РНК-проводника (guide RNA), гибридизирующегося с пре-редактированной и редактированной мРНК Последовательность gRNA между двумя дуплексами определяет эдитинг в сайтах с 1 по 4. Эдитинг закончен, когда достигается полная гибридизация между молекулами

9. Редактирование митохондриальных транскриптов миксомицета Physarum polycephalum Myxomycota – древние эукариоты, одни из первых «обладателей» митохондрий Всего в митохондриальных РНК Physarum обнаружено около 1000 точек эдитинга, причем они располагаются не только в белок-кодирующих матрицах, но и в рРНК, и в тРНК.

10. Редактирование Physarumпроисходит в основном путем инсерций цитидина. В одной молекуле мРНК α-АТФазы было обнаружено 54 некодированных цитидинов. Обнаружены также инсерции динуклеотидов: GC, GU, CU, AU , AA Вставки наблюдаются в среднем через каждые 15-35 нуклеотидов, в рРНК – через ~45 нуклеотидов От 9 до 64 нуклеотидов встраиваются в мРНК матрицыPhysarum

11. Редактирование у миксомицетов каким-то образом связано с транскрипцией Инсерции мРНК происходят по позициям, находящимся на расстоянии не далее 14-22 нуклеотидов от сайта, который в это время транскрибируется (а возможно и гораздо ближе) Механизмы узнавания сайтов и биохимические процессы эдитинга у Physarum пока неясны. ??? В плазмидах, содержащихся в митохондриях Physarum, сайты эдитинга не обнаруживаются, что свидетельствует об ином происхождении плазмид

12. Редактирование митохондриальных мРНК растений было обнаружено одновременно в трех лабораториях CGGв универсальном генетическом коде определяет аргинин В митохондриальных генах растений CGG Неуниверсальность генетического кода в митохондриях растений? Почему? триптофан Загадка разрешилась после секвенирования кДНК этих генов: во многих сайтах мРНК были обнаружены C – U замены

13. Сайты эдитинга белок-кодирующих областей митохондриальных транскриптов пшеницы Оказалось, что эдитингу подвергаются все гены, кодируемые митохондриальной ДНК растений, причем по множеству сайтов

14. Распределение сайтов эдитинга может быть весьма гетерогенным – даже в различных экзонах одного и того же гена Сайты эдитинга в транскриптах некоторых митохондриально кодируемых субъединиц Комплекса 1 у пшеницы nad 4 nad 5 Каждая стрелка соответствует одному сайту эдитинга

15. У некоторых видов выявлено более 400 точек C – U конверсий митохондриальной мРНК только в четырех случаях обнаружены обратные превращения U – C:в мРНК геновcox3пшеницы cox2 гороха и энотеры cobэнотеры

16. C–U превращения, чаще всего происходящие при эдитинге, могут значительно изменить рамки считывания • Описаны случаи • появления новых рамок считывания: (ACG) C–U (AUG), • тре мет • образования стоп-кодонов: • глу CAAUAA • глу CAGUAG • арг CGAUGA • (U–C эдитинг у Ceratophyllum наоборот, аннулирует • стоп-кодоны) • изменение аминокислотных последовательностей белков • Идентификация точек эдитинга в какой-то ORF указывает на то, что данная рамка считывания, скорее всего, является функционирующим геном. Обрывание рамки считывания

17. В митохондриальных транскриптах пшеницы 14 процентов нуклеотидных замен (56 сайтов) оказываются нейтральными и не ведут к аминокислотным изменениям в белках Чем вызвана необходимость эдитинга в этих сайтах ??? Возможно, редактирование приводит к изменению конформации молекул, что облегчает связь с рибосомами ???

18. Чем определяется специфичность эдитинга ??? Например, в транскрипте orf206 редактируется до 68 цитидинов – это 25% всех цитидинов в мРНК orf206. Какой механизм определяет редактирование определенного цитидина, а не соседнего с ним? Пока не удалось выявить ни какой-либо консенсусной последовательности, ни какого-то мотива во вторичной структуре, который мог бы служить "указателем" сайта эдитинга

19. В митохондриальных мРНК растений огромное количество сайтов эдитинга (500 -1200 точек) Маловероятно наличие специфических белковых молекул, узнающих каждая свой сайт Скорее всего, будут найдены РНК-молекулы, которые могут действовать как транс-детерминанты (подобно gРHK у кинетопластов), так и цис-детерминанты, образующие специфическую вторичную структуру, узнаваемую ферментами эдитинга

20. Где же «прячутся» guide РНКв митохондриальном геноме растений? • Информационная емкость генома митохондрий высших растений вполне достаточна для кодирования gРHK. • Однако, скрининг митохондриального генома у Arabidopsis(200000 нуклеотидов с неустановленной функцией)не выявил антисмысловых последовательностей, которые могли выполнять роль gРНК. • Интересно, что у маршанции, у которой отсутствует мРНК эдитинг в митохондриях, "излишней" ДНК значительно меньше – 70000 нуклеотидов

21. Как соотносятся процессы сплайсинга и эдитинга? Обычно редактирование мРНК и сплайсинг интронов – два посттранскрипционных процесса, которые происходят параллельно и независимо друг от друга Если сайты эдитинга расположены в самих интронных последовательностях – редактирование предшествует сплайсингу

22. В большинстве случаев эдитинг белок-кодирующих сайтов приводит к синтезу функционально полноценных белков У табака нарушение эдитинга atp9 мРНК препятствует развитию пыльцы У пшеницы эдитинг гена cox2 по 235 нуклеотиду превращает треониновый кодон в метиониновый. Метионин незаменим в структуре одного из медь-связывающих доменов COX2 У генов пшеницы orf575 и orf240 эдитинг приводит к замене аргининовых кодонов на триптофановые.Восстанавливается консенсусная последовательность в обоих белках, необходимая для связывания с гемом

23. Редактирование структурных РНК посттранскрипционным изменениям могут подвергаться не только информационные, но и транспортные РНК ядерно кодируемые митохондриально кодируемые дезаминируют 37-ой аденозин антикодоновой петли эукариот в инозин тРНКAla A I Данный сайт редактирования обладает поразительным филогенетическим долголетием – он сохранился в клетках от дрожжей до человека

24. Митохондриальные тРНК простейшего Acanthamoeba Точки тРНК эдитинга были предсказаны, а затем все они были найдены A A A A A A A U U G A C G A C G A C G A C G-C A G*U G U C A-U A C U G U C G-C A U U G U C A-U A U G-C A U U U-A U-A C-G C-G G-C U*G A-U G- C C-G C-G A-U G-C A-U U-A C-G U-A U-A C-G A-U A-U U-A A-U A-U A-U Механизм нахождения точек эдитинга как-то связан с вторичной структурой тРНК Акцепторные участки тРНК Наблюдаются замены: U – A , G – A, A – G, U – G и U – C Редактирование восстанавливает комплементарность оснований

25. C U Редактирование тРНК матриц может изменять кодон-специфичность Ген считался аспарагиновым по гомологии с др. млекопитающими Didelphis (опоссум) мт-тРНКAsp нередактир. редактир. Антикодон GUC Антикодон GCC глицинаспарагин мт-тРНКGly обычно узнает 4 кодона - GGN, а у опоссума только 2 - GGА и GGG мт-тРНКAspпосле эдитинга узнает 2глициновых кодона - GGС и GGU

26. У высших растений описано 4 случая тРНК эдитинга: тРНКPhe тРНКPhe тРНКCys бобы картофель энотера тРНКHisлиственница – первый известный случай тРНК эдитинга у голосеменных • У всех видов тРНК эдитинг предшествует процессингу, • затем наблюдается быстрый процессинг отредактированных молекул, • не прошедшие эдитинг тРНК не связываются с аминокислотами и деградируют

27. Формирование фенилаланиновой тРНК в митохондриях растений – многоступенчатый процесс A C C UА UА U А тРНКPhe 5’ ДНК 3’ транскрипция 5’ 3’ С А т-РНК-предшественник РНК-эдитинг “эдитосома” 5’ 3’ РНК-процессинг Зрелая молекула CCA достройка

28. РНК-редактирование хлоропластного генома кукурузы В рамках гены с сайтами эдитинга, числа в скобках – количество сайтов эдитинга в гене

29. В хлоропластном геноме значительно меньше сайтов эдитинга, чем в митохондриальном геноме растений Хп кукурузы – 27 сайтов эд. Хп табака – 31 сайт Мт кукурузы – найдено 364 сайта, предполагается > 1200 cайтов Во всех случаях эдитинга хлоропластной мРНК высших растений выявлены только C-U превращения, тогда как у низших растений обнаружены также U – C замены Проблема специфичности, т.е. нахождения сайтов эдитинга не решена ни для митохондриальной, ни для пластидной мРНК растений

30. Сходство пластидных и митохондриальных систем РНК-эдитинга у растений Основной тип превращений как в митохондриальных, так и в хлоропластных РНК: C-U эдитинг Крайне редко в обоих типах органелл отмечается U – C эдитинг Наиболее часто редактируются вторые нуклеотиды кодонов, часто наблюдаются определенные типы превращений • эдитингу подвергаются преимущественно мРНК • редкие случаи эдитинга описаны для митохондриальных тРНК, ни одного такого случая до сих пор не зафиксировано в пластидах

31. Эдитинг у млекопитающих был впервые открыт при анализе экспрессии гена аполипопротеина В(apoB) apoBмРНК печеньтонкий кишечник CAACAAUAA(стоп-кодон) нередактиров.мРНК редактирование 6666-го нуклеотида apo B100 (512 kDa) apo B48 (241 kDa)

32. Два белка, синтезирующиеся на apo B матрице, выполняют различную роль в метаболизме липидов apo B48 задействован в транспорте жиров, поступающих с пищей и всасывающихся в кишечнике apo B100 вовлечен в транспорт эндогенно синтезированных триглицеридов и холестерола Оказалось, что катализирует превращение цитидина в уридин фермент, названный APOBECIи являющийся цинк-содержащей цитидин дезаминазой с молекулярным весом 27 kDa

33. Был клонирован ген, кодирующий APOBECI у человека, показана его локализация на 12-ой хромосоме Экспериментально созданные трансгенные кролики и мыши экспрессировали данный ген в печени, что приводило к"гиперэдитингу" – редактированию других цитозинов в apoB мРНК и даже других мРНК Это вызывало серьезные нарушения функционирования печени вплоть до канцерогенеза

34. Редактирование ядерных мРНК Описан эдитинг гена чувствительности к опухоли Вильмса WT1 Происходит редкое превращение U–C Leu-280 (CUC) заменяется на пролиновый (CCC) подавляется ингибирующее действие WT1 фактора, что может иметь значение в генезе опухоли

35. Поиск точек РНК-редактирования (ткани мозга человека) Проанализировано 6768 кДНК клонов Все точки эдитинга были А-I заменами

37. В различных генетических системах в редактировании задействованы совершенно непохожие механизмы: вероятно, мРНК эдитинг неоднократно возникал заново в эволюции Является ли эдитинг "реликтом" пребиотического РНК-ого мира или это позднейшее приобретение ??? Отсутствие эдитинга в органеллах водорослей и некоторых других низших растений говорит в пользу более позднего его появления Возникновение эдитинга часто связывают с выходом растений на сушу. Действительно, редактирование выявлено во всех группах наземных растений

38. Эдитинг наблюдается только у наземных растений семенные растения папоротники эдитинг нет эдитинга Fern allies печеночники Marchantiidae 7 видов Jungermannidae мхи Hornworts (Anthoceros) земля вода Сharales 4 вида зеленые водоросли

39. РНК-эдитинг – строго специфическое посттранскрипционное изменение информационных и структурных РНК, состоящее во вставках, заменах и выпадениях нуклеотидов Редактирование - необычный, сложный, требующий координирования большого количества факторов, энергоемкий генетический процесс Возникновение РНК-эдитинга в эволюции и его разнообразные проявления во многих генетических системах являются пока во многом непонятным феноменом Во многих системах роль эдитинга остается загадкой