บทที่ 18 พันธุศาสตร์และเทคโนโลยีทาง DNA (Genetics and DNA technology)

1. บทที่ 18 พันธุศาสตร์และเทคโนโลยีทาง DNA (Genetics and DNA technology) ครูเอื้อมพร เอี่ยมแพร

2. เทคโนโลยีชีวภาพ (Biotechnology) • การใช้เทคโนโลยีเพื่อทำให้สิ่งมีชีวิต หรือองค์ประกอบของสิ่งมีชีวิตมีสมบัติตามต้องการ ยกตัวอย่างเช่น • การใช้จุลินทรีย์ในการหมัก • การพัฒนาปรับปรุงพันธุ์พืชและสัตว์ • เทคโนโลยีชีวภาพที่เกี่ยวกับ DNA (DNA Technology)

3. พันธุวิศวกรรม (Genetic Engineering) • พันธุวิศวกรรม (genetic engineering) หมายถึง เทคโนโลยีที่ทำการเคลื่อนย้ายยีน (gene) จากสิ่งมีชีวิตสปีชีส์หนึ่งไปสู่สิ่งมีชีวิตอีกสปีชีส์หนึ่ง เป็นการสร้าง DNA สายผสม (recombinant DNA) • สร้างสิ่งมีชีวิตรูปแบบใหม่ (novel) ที่มีคุณลักษณะแบบใหม่ ซึ่งไม่เคยปรากฏในธรรมชาติมาก่อน • เปลี่ยนแปลงหน่วยพันธุกรรม หรือ DNA ของสิ่งมีชีวิต • เคลื่อนย้ายยีนที่อยู่เหนือกฎเกณฑ์ธรรมชาติ สิ่งมีชีวิตที่เกิดขึ้นอาจมียีนลูกผสมแบบใหม่

4. การโคลนยีน Cloning : หมายถึง กระบวนการสร้างสิ่งที่มีลักษณะทางพันธุกรรม เหมือนกันกับสิ่งที่มีอยู่ก่อน มนุษย์รู้จักโคลนนิ่งมาแต่สมัยโบราณแล้ว แต่เป็นการรู้จักโคลนนิ่ง ที่เกิดกับพืช นั่นคือ การขยายพันธุ์พืชโดย ไม่อาศัยเพศ เช่น การแตกหน่อ http://www.youtube.com/watch?v=OCro5zfc3uc&feature=player_embedded#at=42

5. กระบวนการในพันธุวิศวกรรมกระบวนการในพันธุวิศวกรรม ประกอบด้วยกระบวนการโดยรวมคือ • การเตรียมยีน (gene)หรือ DNA ที่สนใจ • การตัดDNA อย่างจำเพาะด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ • การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNA ที่แยกได้กับ DNA พาหะ(vector)เช่นพลาสมิด(plasmid), phage, cosmid • การนำพาหะ(vector)ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่หรือ DNA สายผสมใส่เข้าไปในเซลล์ผู้รับ (host) • หลังจากนั้นเลี้ยงเซลล์ผู้รับให้แบ่งเซลล์หลายๆครั้งทำให้เพิ่มจำนวนเซลล์หรือเพิ่มปริมาณยีนที่น่าสนใจกระบวนการนี้เรียกว่าการโคลนยีน(gene cloning) • การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ

6. การโคลนยีน

7. 1.การเตรียมยีน (gene)หรือ DNA ที่น่าสนใจ การเตรียมชิ้นส่วนยีนหรือ DNA ที่น่าสนใจมีหลายวิธีดังนี้ • การสกัดจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิตที่ต้องการศึกษาซึ่งเป็น DNA ทั้งหมดในจีโนมของสิ่งมีชีวิตชนิดนั้นเรียกว่าgenomic DNA • การเตรียม DNA จากmRNA • โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase • จะได้ DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นหรือถอดรหัสจากmRNAเรียกว่าcomplementary DNA (cDNA) • การสังเคราะห์ DNA โดยวิธีทางเคมี • สามารถสังเคราะห์oligonucleotideให้มีลำดับเบสที่ต้องการโดยเครื่องสังเคราะห์อัตโนมัติ • มี2วิธีที่ใช้กันอย่างกว้างขวางคือวิธีphosphate triesterและวิธีphosphitetriester

8. 2. การตัด DNA อย่างจำเพาะด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ • เอนไซม์ตัดจำเพาะ(Restriction enzyme or restriction endonuclease) • แบบที่ 2 (type II) เป็นเอนไซม์ที่ใช้กันมากในการตัดต่อยีน • ประกอบด้วยโพลีเพพไทด์เพียงชนิดเดียว • การตัด DNA จะเกิดที่ตำแหน่งจำเพาะในบริเวณจดจำ(recognition site) หรือจุดใกล้กับบริเวณจดจำทำให้ได้ชิ้นขนาด DNA ที่มีขนาดแน่นอน

9. ตัวอย่างเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme)

10. Blunt end vs. sticky end

12. 3. การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNA ที่แยกได้กับ DNA พาหะ (vector) • การเชื่อมต่ออาศัยเอนไซม์ ligase • การทำพันธุวิศวกรรมต้องนำ DNA ที่สนใจเข้าสู่ภายในเซลล์ผู้รับ โดยอาศัย DNA พาหะ(vector) • คุณสมบัติของ DNA พาหะ(vector)มีดังนี้ • มีส่วนของ DNA ที่เป็นจุดเริ่มในการจำลองตัว(origin of replication,ORI) ทำให้สามารถเพิ่มจำนวนตัวเองได้พร้อมๆกับ DNA ที่ใส่เข้าไป • มียีนเครื่องหมาย(marker gene) สำหรับใช้ในการคัดเลือกเช่น ยีนที่ดื้อยาปฏิชีวนะ ยีนที่เกี่ยวกับการสร้างหรือสลายกรดอะมิโนและน้ำตาลบางชนิด • มีบริเวณจดจำของเอนไซม์ชนิดใดชนิดหนึ่งหรือหลายชนิดเพียง ตำแหน่งเดียวในโมเลกุลของ DNA พาหะ(unique or polylinker site)

13. ชนิดของ DNA พาหะ(vector) ขึ้นอยู่กับขนาดของ DNA ที่นำมาเชื่อมและเซลล์ผู้รับ ตารางแสดง DNA พาหะ(vector)ชนิดต่างๆและขนาดของชิ้น DNA ที่แทรกในพาหะได้

14. pBR322, 4.36kb

15. Plasmid

19. Fig. 14-9: Cloning by cosmids. The cosmid is cut at a BglII site next to the cos site. Donor genomic DNA is cut using Sau3A, which gives sticky ends compatible with BglII. A tandem array of donor and vector DNA results from mixing. Phage is packaged in vitro by cutting at the cos site. The cosmid with inserts recircularizes once in the bacterial cell.

21. 4. การนำพาหะ(vector)ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่หรือ DNA สายผสมใส่เข้าไปในเซลล์ผู้รับ • ขั้นตอนการนำ DNA สายผสม ใส่เข้าไปในเซลล์ผู้รับมีหลายวิธี คือ 4.1 Transformation • เป็นการนำ DNA ในรูปplasmidเข้าสู่เซลล์ผู้รับ • เซลล์ผู้รับที่นิยมใช้กันมากคือE. Coli • โดยทำให้เซลล์ผู้รับเป็น competent cell ก่อน มีสองวิธีคือ • การใช้สารเคมี เช่น dimethyl sulfoxide-DMSO, CaCl2, MgCl2 • Electroporation- ใช้กระแสไฟฟ้าทำให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์ ทำให้ DNA หรือพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้ • การใช้แสงlaser ทำให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์

22. 4.2 Transfection • เป็นการนำ DNA ของphageที่มีขนาดเล็กเช่นM13 เข้าสู่เซลล์ผู้รับ • เมื่อแบคทีเรียได้รับ DNA ของphageจำนวนมากเซลล์จะแตกและphageจะบุกรุกเซลล์อื่นต่อไปทำให้เกิดจุดใส(clear plaque) • จุดใส(clear plaque)คือจำนวน DNA ของphageที่เข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย 4.3 Transduction • เป็นการนำ DNA ของcosmid,lamda phage ที่มีขนาดใหญ่เข้าสู่เซลล์ผู้รับ • โดยบรรจุลงในอนุภาคของphage ก่อนแล้วจึงนำเข้าเซลล์ • วิธีนี้มีประสิทธิภาพสูงกว่าTransformation

23. จุดใส (clear plaque) • คือจำนวน DNA ของphageที่เข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย

24. 5.การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ 5.1 การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype) • เป็นการอาศัยการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย (marker gene) และมีการสร้างโปรตีนออกมา • เช่น การสร้างเอนไซม์บางชนิดที่ทำให้เกิด clear zone ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี substrate (IPTG) อยู่ • หรือพบลักษณะการดื้อยาในเซลล์ผู้รับที่ได้รับมาจากพลาสมิด

25. 5.2 การคัดเลือกโดย DNA hybridization • อาศัยการจับคู่กันของสาย DNA ที่เป็นตัวติดตาม (probe) กับ DNA เป้าหมายที่ต้องการตรวจหาที่มีลำดับเบสคู่สมกัน บนmembrane • โดย probeจะติดฉลากด้วยสารไอโซโทปหรือเอนไซม์ 5.3 การคัดเลือกโดยวิธีทางอิมมิวโนวิทยา • ทำได้เมื่อโคลนที่ต้องการแสดงออกได้ โดยผลิตโปรตีน แต่โปรตีนไม่แสดงลักษณะหรือphenotypeที่ชัดเจน • เป็นการตรวจสอบโปรตีนที่เซลล์ผลิตขึ้นโดยใช้แอนติบอดีที่จำเพาะกับโปรตีนที่ต้องการนั้น

26. การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype) • Plasmid/phageที่มีส่วนของยีนที่สร้าง b-galactosidase จะสร้างเฉพาะ a-fragment • เมื่อ Plasmid/phage ถูกนำเข้าสู่แบคทีเรีย ภายใต้ภาวะที่ถูกกระตุ้นด้วย IPTG จะทำให้มีการสร้าง b-galactosidaseในแต่ละ fragment ซึ่งสามารถเปลี่ยน X-gal ให้เป็นสีน้ำเงินได้ • แต่ถ้ามี foreign DNA มาเชื่อมจะทำให้เกิดการทำงานของยีนดังกล่าวบกพร่อง • ไม่มีการสร้าง b-galactosidase ไม่สามารถเปลี่ยน X-gal ได้จึงให้โคโลนีสีขาว

27. Polymerase Chain Reaction (PCR) • เพิ่มจำนวน DNA ในหลอดทดลอง • เครื่องมือ thermocycler

29. ขั้นตอนของกระบวนการ PCR • การแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกัน (Denaturation) ใช้อุณหภูมิ ประมาณ 94 องศาเซลเซียส เมื่อเริ่มต้นดีเอ็นเอแม่แบบ จะอยู่ในลักษณะที่เป็นเกลียวคู่ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิถึงประมาณ 94 องศาเซลเซียส จะทำให้พันธะไฮโดรเจนระหว่างคู่เบสของดีเอ็นเอถูกทำลาย ทำให้เส้นดีเอ็นเอแยกออกจากกัน • การจับของไพรเมอร์กับ DNA แม่แบบ (Annealing) เมื่อแยกสายดีเอ็นเอออกจากกันแล้ว จะลดอุณหภูมิลงเหลือ 40 - 62 องศาเซลเซียส เพื่อให้ดีเอ็นเอสังเคราะห์ขนาดสั้นประมาณ 15 - 25 คู่เบส ที่เรียกว่า ไพร์เมอร์ (Primer) เข้ามาจับบริเวณที่มีลำดับเบสคู่สมกัน ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ

30. 3. การสังเคราะห์ DNA สายใหม่ต่อจากไพรเมอร์ (Extension) ใช้อุณหภูมิ ประมาณ 68-72 องศาเซลเซียส ในขั้นตอนนี้จะเป็นการสร้างสายดีเอ็นเอต่อจากไพร์เมอร์ โดยอุณหภูมิที่ใช้จะพอเหมาะกับ การทำงานของ Taq DNA polymerase

31. http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf • http://www.sciencemedia.com/website/demos/biochem/PCRMutagenesis.swf

32. ลายพิมพ์ DNA (DNA Fingerprint)

33. ลายพิมพ์ DNA (DNA Fingerprint) DNA ทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตนั้นประกอบด้วย 2 ส่วน   • coding DNA     ทำหน้าที่ควบคุมการสร้างโปรตีนที่มีความสำคัญต่อกลไกต่างๆ ภายในร่างกาย  ซึ่งจะมีอยู่เพียงร้อยละ 5 ของชุด DNAทั้งหมด  • noncoding DNA  ร้อยละ 95 มีส่วนหนึ่งที่เป็นเบสซ้ำต่อเนื่อง (tandem repeat)  อยู่หลายตำแหน่ง  

34. Tandem Repeat เบสซ้ำต่อเนื่องนี้เองที่นำมาทำเป็นลายพิมพ์ดีเอ็นซึ่งเป็นเครื่องหมายพันธุกรรม  ทำให้สามารถรู้ลักษณะของจำนวนการซ้ำของท่อน DNA  แต่ละชุดในแต่ละตำแหน่งบนสาย DNA  ของสิ่งมีชีวิตและบุคคลได้    สามารถใช้ความแตกต่างกันของขนาดและจำนวนการซ้ำของท่อน DNA แต่ละชุดนี้ บ่งบอกถึงข้อมูลพันธุกรรมเฉพาะของแต่ละบุคคลได้  

35. หลักการทำงานของเทคโนโลยีลายพิมพ์ DNA • เก็บตัวอย่างเซลล์ ตัวอย่างต้องมี DNA ที่มีคุณภาพ ไม่เสื่อมสลาย (ปัจจัยที่ทำให้ DNA เสื่อมสลายคือ ระยะเวลา อุณหภูมิ ความชื้น แสงแดด สารเคมี จุลินทรีย์ ฯลฯ) • สกัด DNA จากเซลล์ของตัวอย่าง • ตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ หลักการคือ เลือกตัด DNA ในส่วนที่แสดงเอกลักษณ์เฉพาะบุคคล โดยใช้ restriction enzyme จากนั้นนำชิ้นส่วน DNA ที่ถูกตัดมาวิเคราะห์ตามขนาดด้วยวิธี Gel Electrophoresi • แปลผลลายพิมพ์ DNA โดยการอ่านผลจากลักษณะตำแหน่งของแถบดีเอ็น หรือกราฟที่ได้

36. ประโยชน์ของลายพิมพ์ DNA • ใช้พิสูจน์ความสัมพันธ์ทางสายเลือด • ใช้ในการติดตามการรักษาผู้ป่วยที่ได้รับการปลูกถ่ายไขกระดูก ในการรักษาลูคีเมีย ผู้ป่วยต้องรับการปลูกถ่ายไขกระดูกจากผู้ให้ หากลายพิมพ์ดีเอ็นเอเลือดผู้ป่วยเปลี่ยนไป แต่ลายพิมพ์เซลล์อื่น ๆ เหมือนเดิม แสดงว่าร่างกายไม่ปฏิริริยาต่อต้านไขกระดูกจากผู้ให้ • ใช้พิสูจน์หลักฐานทางนิติเวชศาสตร์

37. Gel Electrophoresis Electrophoresis เป็นเทคนิคที่ใช้แยกโมเลกุลของสารที่มีประจุออกจากกันโดยใช้กระแสไฟฟ้า สารที่มีประจุนั้นเคลื่อนที่ผ่านตัวกลางชนิดหนึ่งในสารละลาย สารที่ประจุต่างกันจะเคลื่อนที่ไปในทิศทางตรงกันข้าม อัตราการเคลื่อนที่ยังขึ้นอยู่กับขนาด รูปร่างโมเลกุล แรงเคลื่อนไฟฟ้าและตัวกลางที่ใช้ด้วย

38. โมเลกุลของ DNA ประกอบด้วยหมู่ฟอสเฟตจำนวนมาก สารละลายของ DNA จึงมีประจุเป็นลบที่ pH เป็นกลาง เมื่ออยู่ในสนามไฟฟ้าโมเลกุลของ DNA จะเคลื่อนที่จากขั้วลบไปยังขั้วบวก ความเร็วในการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA จึงขึ้นอยู่กับขนาดเป็นส่วนใหญ่ อย่างไรก็ตามมีปัจจัยอื่นที่มีผลต่อการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA ด้วยดังนี้

40. การประยุกต์ใช้เทคโนโลยีของ DNA • เชิงการแพทย์และเภสัชกรรม • การวินิจฉัยโรค • การบำบัดด้วยยีน • การสร้างผลิตภัณฑ์ทางเภสัชกรรม • เชิงนิติวิทยาศาสตร์

42. เชิงการเกษตร • การทำฟาร์มสัตว์เพื่อสุขภาพมนุษย์ • การสร้างสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (transgenic organisms) • การใช้พันธุศาสตร์เพื่อศึกษาค้นคว้าหายีนและหน้าที่ของยีน • การประยุกต์ใช้เพื่อสิ่งแวดล้อม