ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI.

1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKAVI. ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2. ELEKTROFORÉZIS ELEKTROMIGRÁCIÓ SZABAD HATÁRFELÜLETŰ (ZÓNA) ELEKTROFORÉZIS GÉLELEKTROFORÉZIS DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS

3. Arne TISELIUS professzor

7. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Tiselius (1925 – 1930) Szabad határfelületű (zóna) elektroforézis, 1948 Nobel-díj Elektroforézis hordozók bevezetése (1930 – 1950) - porok (cellulóz) - szűrőpapír - gélek (hidrolizált keményítő, agar-agar, agaróz, agaropektin) - membránok (cellulóz acetát) Poliakrilamid gélek (1950 – 1960) - pórusméret, molekulaszűrés, gradiens technikák - készülék fejlesztések (slab – disc, horizontális – vertikális) Detergens gélelektroforézis, SDS-PAGE (1960 – 1970) - Izoelektromos fokuszálás Kapilláris elektroforézisés kapcsolt technikák 1990 – től - CZE, CGE, MEKC, CIEF, CITP, ACE, CEC

8. AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI ELVÁLASZTÁS ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN TÖLTÉSSEL RENDELKEZŐ MOLEKULÁK ELTÉRŐ ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁSA ALAPJÁN AZ ELVÁLASZTÁS TÉNYEZŐI AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR

9. AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI ELEKTROMOS TÖLTÉSSEL RENDELKEZZEN (POZITÍV, VAGY NEGATÍV, IZOELEKTROMOS PONT, pI), IONIZÁLHATÓ (INDUKÁLHATÓ), VAGY IONOS ÁLLAPOTBA HOZHATÓ (detergens micella) LEGYEN, KÉMIAI SZERKEZETE (stabilitás), FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI (disszociáció, erős – gyenge) KÖLCSÖNHATÁSAI (aggregáció, asszociáció) MÉRETE – TÖMEGE (kis molekulák – biopolimerek – fehérjék) ALAKJA (globuláris – fibrilláris) BELSŐ VISZKOZITÁS (konformáció) OLDÉKONYSÁG, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS

10. IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK A FEHÉRJÉK MOLEKULA SZERKEZETÉBEN

11. A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggése (eltérése) a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a– Stokes-féle rádiusz, D–diffuziós állandó, υ– molekula fajlagos parciális térfogata, η– viszkozitási együttható.

12. AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) HALMAZÁLLAPOTA Folyadék (szabad határfelületű, vagy zónális), Szilárd (cellulóz – papír, szemcsék, membránok) Félfolyékony rendszerek (gélek, hidrofil polimerek) MINŐSÉGE Polaritás, dielektromos állandó, oldószer erősség, Viszkozitás, Hőmérséklet (hűtés !), ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK Ionerősség – ion minőség, pH (puffer) AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI

13. AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

14. TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

15. N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

17. ELEKTROFORÉZIS AZ ELEKTROFORÉZIS KÖZEGÉNEK JELLEMZŐI • IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol:

18. AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR JELLEGE – HOMOGENITÁSA Lineáris – radiális, síkban – térben, INTENZITÁSA E = V . d-1(Volt /m) AZ ELEKTROMOS ÁRAMKÖR Ohm – törvény Joule - hő Q = f (I) V = R . I

19. AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI VÁNDORLÁSI SEBESSÉG() ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS()  (Volt-1sec-1m2) t idő (sec) • = a molekula összetett paramétere, ~10-8 (előjel – irány) „net charge” - eredő (össz) töltés, ionizáltsága (erössége-foka) anyagi minősége, hidrodinamikai ellenállása, közeg viszkozitása, ionerőssége-ion minősége, pH-ja, speciális vezetőképessége STOKES-féle törvény frikciós együttható (f) i= qi / 6r f = 6r

21. AZ ELEKTROFORÉZIS GYAKORLATA • Analitikai – preparatív (oszlop, réteg) • Horizontális - vertikális • Disc - slab - kapilláris • Kontinuus - diszkontinuus • Detergens gélelektroforézis (SDS - PAGE) • Moltömeg (méret) meghatározás • Izoelektromos fókuszálás (IEF), pl

22. Tiselius (1948) Nobel-díj SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA” ELEKTROFORÉZIS HORIZONTÁLIS papír keményítő membrán (cellulóz acetát) GÉL (agaróz, dextrán, poliakril amid) ELEKTROFORÉZIS H

23. HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA „KLASSZIKUS” PAPÍRELEKTROFORÉZISSEL LDL HDL ( + )

24. HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

25. HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA ELFO VLDL LDL HDL UC

26. HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN FESTÉS Sudan Black B

28. HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

29. HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ÉS LIPIDEK ÖSSZEHASONLÍTÓ DIAGNOSZTIKAI VIZSGÁLATA

30. ELŐFESTETT EGÉR SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL VLDL LDL HDL

31. FEHÉRJÉK MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁSA VERTIKÁLIS (SLAB) PÓRUS-GRADIENS SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL LMW MOLEKULATÖMEG STANDARD FEHÉRJÉK

32. EHRLICH ASCITES TUMORSEJT MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

33. HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS GLIKOPROTEINEK DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS (SDS-PAGE) VIZSGÁLATA FESTÉS COOMASSIE BRILLANT BLUE PERJODÁT-SCHIFF (PAS) AGP

34. HUMÁN SZÉRUM AGP GENETIKAI VARIÁNSAINAK ELVÁLASZTÁSA IZOELEKTROMOS FOKUSZÁLÁSSAL (IEF GÉLELEKTROFORÉZIS) F1 S A O - 8990 O - 9130 L - 1328 NP - XXII pI 4,93 5,03 5,06

35. HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

36. AZ LDH IZOENZIMEK TETRAMER SZERKEZETE ALEGYSÉGEK H ~ MÁJ (HEPAR) M ~ IZOM (MUSCLE)

37. AZ LDH in situ KIMUTATÁSÁNAK SZINREAKCIÓJA LDH PIROSZŐLŐSAV + NADH TEJSAV + NAD FENAZIN METOSZULFÁT NADH + TETRAZÓLIUMKÉK NAP + FORMAZÁN

38. KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK

39. KÜLÖNBÖZŐ KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK DENZITOMETRIÁS KIÉRTÉKELÉSE