Molekylära metoder för kartläggning av genetisk diversitet - en översikt

1. Molekylära metoder för kartläggning av genetisk diversitet - en översikt Oscar Diaz

2. Biodiversitet - Inom populationer (allelkombinationer hos olika individer) 1. Populationsnivå (genetisk diversitet) - Mellan populationer (skillnader i frekvens av olika alleler) 2. Artnivå 3. Ekosystemnivå Oscar Diaz, NGB

3. Area 1 Region 1 Region 2 Region 3 Individual Population u Population j Population 2 Population s Population 1 Population k Population i Population t Population 3 Kartläggning av genetisk variation Mängden och fördelning av genetisk variation kan uppskattas på olika sätt beroende på vilken organisationsnivå man befinner sig på Oscar Diaz, NGB

4. Kartläggning av genetisk variation Fenotypiska egenskaper (genotyp + miljö) Genotypiska egenskaper (genetiska delen hos en individ) Oscar Diaz, NGB

5. Vilka metoder används för att kartlägga den genetiska variationens mängd och fördelning hos en art? Morfologiska metoder Molekylära metoder

6. Fenotypiska egenskaper Fördelar • Kostnadssnåla • Snabbare att studera i jämförelse med molekylära markörer Nackdelar • Oftast miljöpåverkade • Karaktärerna är inte slumpmässigt valda • Svårt att studera skillnader på allel-nivå • Beroende av plantans utveckling Fenotypiska egenskaper utgör ett relativmått som inte kan nyttjas för att beräkna den absoluta genetiska likheten mellan olika material Oscar Diaz, NGB

7. Vilka metoder används för att kartlägga den genetiska variationens mängd och fördelning hos en art? Morfologiska metoder Molekylära metoder

8. DNA (molekylära) markörer Fördelar • Absoluta genetiska skillnader • Ej beroende av miljön • Potentiellt oändlig number av markörer • Mer säkert kvantifiering av genetisk variation Nackdelar • Dyr utrustning oftast behövs Oscar Diaz, NGB

9. Önskade egenskaper av DNA markörer Hög grad av polymorfism Reproducerbarhet kodominant Jämnt fördelad i genomet Att hitta skillnader mellan nära besläktade individer Ej beroende av varken miljö eller av plantans utveckling (hög heritabilitet) Neutral Enkel att använda Billiga Oscar Diaz, NGB

10. Molekylära metoder 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

11. Tissue extract Specific staining procedures Origin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Stärkelsegelelektrofores (SGE) – Polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) Elektroforetisk analys av isozymvariation DNA Protein

12. Molekylära Kriterier 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

13. Probe DNA extraktion Restriktions- enzym Elektrofores Membrane Gel Proben binder sig till motsvarande DNA-sekvens RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Man klipper DNA från en individ med ett antal restriktionsenzymer De erhållna DNA-fragmenten separeras med elektrofores beroende på deras längd Metoden använder sig av “en probe” för att kunna upptäcka de olika banden “En probe” är en kort DNA-sekvens som oftast är märkt med ett radioaktivt ämne. När “proben” binder sig till motsvarande DNA-sekvens kan man identifiera de olika banden

14. Hög grad av reproducerbarhet ko-dominanta markörer Enkel att genomföra om lämpliga prober finns tillgängliga Det krävs stora mängder DNA av hög kvalitet Tidskrävande och dyr Radioaktivitet behövs Ett stort antal artspecifika prober behövs för att hitta variation på populationsnivå RFLP kan kombineras med användning av mikrosatelliter och minisatelliter (s k VNTR), men bandmönstren är oftast mycket svårttolkade RFLP

15. Molekylära Kriterier 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

16. + Primer + Taq polymerase + Nukleotider + Buffert lösning DNA Primer Polymerase PCR (Polymerase Chain Reaction) Cyklisk kedjereaktion som upprepas många gånger för att bilda miljontals kopior av en bestämd DNA-sekvens

17. Ospecifik primer Ospecifik primer Genom PCR-baserade tekniker, med “ospecifika primer” RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) DAF (DNA Amplification Fingerprinting) AP-PCR (Arbitrary Primed Polymerase Chain Reaction) MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling)

18. Molekylära Kriterier 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

19. Genom Specifik primer PCR-baserade tekniker, med “specifika primer” Mikrosatelliter - STMS (Sequence-tagged microsatellites) - SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphisms) - STR (Short Tandem Repeat) - SSR (Simple Sequence Repeat) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SRFA (Selective Restriction Fragment Amplification) AMO (Anchored Microsatellites Oligonucleotides) - ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) SCARs (Sequence-Characterised Amplified Regions) CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

20. Problem med dåligt urval • Om urvalet är för små, blir allelfrekverserna underskattade Oscar Diaz, NGB

21. A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A3 A2A3 n = 48 n = 18 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A2A2 A1A3 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A1 A1A1 A1A1 A1A1 A1A1 A1A1 A1A1 A1A1 A1A1 A1A1 Problem med dåligt urval (forts.) • Om några alleler räknas inte i urvalet: Initial population Frequency of A1 (p) = 25/96 = 0.260 Frequency of A2 (q) = 68/96 = 0.708 Frequency of A3 (s) = 3/96 = 0.031 Sample Frequency of A1 (p) = 8/36 = 0.222 Frequency of A2 (q) = 28/36 = 0.778 Frequency of A3 (s) = 0/36 = 0.000 (lost) Oscar Diaz, NGB

22. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a Aco-1 b a Aco-2 b a Aco-3 b a Aco-4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 a b c Locus ECGA22 d e f g h i j k l 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C10-1 C10-2 C10-3 C10-4 Tolkningen av olika bandmönster Isozymer (Aco) Mikrosatelliter (Primer ECGA22) RAPD (Primer C10)

23. Statistisk bearbetning av resultaten BIOSYS-1 (Swofford & Selander 1989) (A computer program for the analysis of allelic variation in population genetics) Den absoluta mängden av genetisk variation - P = Frekvensen loci med genetisk variation - H = Heterozygoti Fördelningen av den totala genetiska variationen mellan och inom populationen Graden av genetisk likhet mellan populationer - D = “Genetic distance” BIOSYS-1 GENOTYPE FREQUENCY INPUT NOTU=2,NLOC=8,NALL=3 8(1X,A5)) ACO-1 ACO-2 ACO-3 ACO-4 MDH-2 PGD-1 PGD-2 PGM-1 STEP DATA: DATYP=2,NCOL=6,ALPHA; (6X,6(1X,2A1,1X,I2) Population 1 ACO-1 AA:50 ACO-2 BB:20 BC:30 ACO-3 AB:22 BB:28 ACO-4 BB:50 MDH-2 BB:49 BC:01 PGD-1 AA:50 PGD-2 AA:40 AB:10 PGM-1 BB:50 Population 2 ACO-1 AB:50 ACO-2 AB:20 BC:30 ACO-3 AB:22 BC:28 ACO-4 BB:50 MDH-2 BB:49 BC:01 PGD-1 AA:50 PGD-2 AA:40 AB:10 PGM-1 BB:50

24. Dendrogram Sweden PCA = Principal component analysis Iceland Norway PCA-2 = 26.5% PCo-3(13.93%) Russia PCA-1 = 60.5% PCo-2(18.42%) PCo-1(28.08%) PCoA = Principal coordinates analysis Presentation av resultaten NTSYS (F. James Rohlf 1993) Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System

25. Vad ska man tänka på när man väljer en metod för diversitetsstudier? • Hur många loci och alleler/locus behöver man undersöka? • Vilken organisationsnivå tänker man undersöka? • Har den tänkbara metoden en hög reproducerbarhet? • Har det någon betydelse om man väljer dominanta eller kodominanta markörer? Oscar Diaz, NGB

26. Vad ska man tänka på när man väljer en metod för diversitetsstudier? • Är DNA kvalitet en viktig förutsättning? • Finns kompetens tillgänglig? • Är laboratoriet utrustat mer de rätta verktygen? • Hur mycket pengar har man för undersökningen? • Hur mycket tid har man för att få fram resultaten? Oscar Diaz, NGB

27. AFLP Isozym RFLP RAPD SSR Mest använda molekylära metoder för diversitetsstudier Egenskaper Isozym RFLP RAPD Mikrosatelliter AFLP - Organisationsnivå Protein DNA DNA DNA DNA - Baserad på Stärkelsegel Hybridisering PCR PCR PCR elektrofores - Restriktionsenzym Nej Ja Nej Nej Ja - Radioaktivitet Nej Ja/Nej Nej Nej/Ja Ja - Investeringsbehov Mycket Låg Hög Låg Hög Hög - Utvecklingskostnad Mycket Låg Hög Låg Mycket Hög Hög - Kostnad/reaktion Låg Mycket Hög Låg Låg Låg - Prober/dag +++ + ++ ++ ++ - Dataanalys Lätt Lätt Lätt Lätt Svårt - Kunskap/Erfarenhet Låg Hög Mellan Mycket Hög Mycket Hög - Del av genomet (%) Låg/Mellan Låg/Mellan Mellan Låg Låg - Locus-specifik Ja Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej - Polymorfigrad Låg Låg/Mellan Hög Mycket Hög Mycket Hög - Reproducerbarhet Mycket Hög Mycket Hög Låg Mycket Hög Hög - Ärftlighetssätt Kodominant Kodominant Dominant Kodominant Dominant - Lämplig för Population ----- Population Population Population Art Art ---- ---- Art