SLOŽENÍ MÉDIÍ

1. Živina Knop Hoagland a Snyder Murashige a Skoog Gamborg Shenk a Hildebrandt Koncentraceživin v médiu [mmol/l] NO3- 10,94 15,00 39,40 24,72 24,72 Hydroponická média Média pro kultivaci in vitro NH4+ - - 20,61 2,02 2,06 celkový N 10,94 15,00 60,01 26,74 27,32 PO43- 1,84 1,00 1,24 1,08 2,6 SO42- 1,01 2,00 1,50 2,03 1,62 Cl- - - 5,98 2,04 2,72 K+ 4,30 6,00 20,04 24,72 24,72 Na+ - - - 1,08 - Mg2+ 1,01 2,00 1,50 1,01 1,62 Ca2+ 4,23 5,00 2,99 1,02 1,35 TeplotaSvětloVlhkostSložení plynné fázeSložení médiíAseptická kultivaceOšetření mateřských rostlinTyp explantátu SLOŽENÍ MÉDIÍ

2. SLOŽENÍ MÉDIÍ SLOŽENÍ MÉDIÍ pro kultivaci rostlin in vitro • Makroprvky • Mikroprvky Nezbytné c) Vitaminy d) Aminokyseliny e) Sacharidy f) Doplňky g) Pufry h) Růstové regulátory i) Zpevňující složky Prospěšné až nezbytné

3. energie NO3- NH4+ SLOŽENÍ MÉDIÍ • Makroprvky – N, P, K, Ca, Mg, S Důležitá jak koncentrace, tak vzájemná vyváženost. N – nejprve jako zdroj N používány NO3-; přidání redukované formy NH4+může být prospěšné Cyklus kyseliny citrónové 2- oxoglutarát • Proč ne jen NH4+??? • toxicita při vyšších koncentracích • (kompenzovat přídavkem kyselin Krebsova cyklu) • příjem vede k poklesu pH potřeba pufrovat média glutamát glutamin glutamát (2) NH4+

4. Příjem NO3- při pH, ……………. příjem NH4+ připH NO3- OH- NH4+ H+ SLOŽENÍ MÉDIÍ NO3- OH- NH4+ H+  pH  pH V médiu NO3-+NH4+ (počáteční pH média 5,4 -5,8)   nejdříve příjem NH4+   pH následuje příjem NO3-  pH

5. SLOŽENÍ MÉDIÍ b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo Jsou součástí metabolicky a fyziologicky důležitých proteinů Chelatony - EDTA c) Vitaminy B1, B6, kys. nikotinová, (inositol) Rostliny jsou schopny vitaminy syntetizovat, rostlinné explantáty často nejsou soběstačné d) Aminokyseliny Okamžitě dostupný zdroj N; rychlejší příjem; organické a anorganické zdroje N nejsou zaměnitelné !!! Hydrolyzát kaseinu – směs aminokyselin a peptidů Samostatně : glycin, pro některé kultury k.glutamová, glutamin, k.asparagová, asparagin, … ostatní výjimečně

6. ??Navození autotrofie v podmínkách in vitro – typ kultury • vynechání sacharidu z média • zvýšení koncentrace CO2 ( konc. CO2 v okolí nádob, propustné uzávěry • kultivačních nádob) • zvýšení ozářenosti, spektrum použitého světla ??Vliv sacharidů v médiu na schopnost kulturyfotosyntetizovat Heterotrofní kultury – plně závislé na vnějším zdroji C Mixotrofní kultury – fotosyntetizující + zásobované z média SLOŽENÍ MÉDIÍ • Sacharidy • Zdroj C a energie Explantátové kultury nejsou většinou autotrofní  nutnost dodat zdroj C a energie z média ??Mixotrofie X úspěšnost přenosu do ex vitro podmínek

7. rozkládat daný sacharid vně buněk (sacharóza  glukóza + fruktóza, rafinóza  ? fruktóza + melibióza nebo sacharóza + galaktóza) • přijímat daný sacharid (pasivní transport X aktivní transport) • transportovat daný sacharid (z buňky do buňky x vodivými pletivy) • utilizovat daný sacharid (např. manitol, sorbitol, RFO) Př:Listové disky Capsicum annum tvorba výhonů - glukóza Př:kultury izolovaných kořenů pšenice (a dalších jednoděložných) – glukóza Př:některé orchideje - fruktóza Př:kalus fazolu, somatická embrya jedle - maltóza Př:Rosaceae – sorbitol, jasan, celer, oliva – manitol Př:embryogenese u citrusů -galaktóza Př:kalus okurky - rafinóza SLOŽENÍ MÉDIÍ ??Jaký sacharid a v jaké koncentraci Nejčastěji: sacharóza 1-3 % - floémem transportovatelný sacharid u všech rostlin Dále: glukóza, maltóza, fruktóza, galaktóza, manóza, laktóza, manitol, sorbitol, rafinóza.. Požadavky se mohou velmi lišit v závislosti na rostlinném druhu i typu kultury a jejím vývoji ! Výběr vhodného sacharidu často na základě empirického přístupu Využitelnost sacharidu závisí na schopnosti kultury :

8. SLOŽENÍ MÉDIÍ • Osmotikum Přítomnost sacharidu v médiu snižuje osmotický potenciál média osmotický stres (morfogenní signál) Př:Somatická embryogeneze jehličnanů – pozitivní vliv vysokých koncentrací sacharózy lze nahradit osmotickým stresem vyvolaným manitolem • Osmoprotektant Přítomnost sacharidu v buňkách osmotické přizpůsobení (zachování transpotru vody při osmotickém stresu) osmoprotekce (ochrana membrán a makromolekul při nedostatku vody) • Signální molekula • přímé působení sacharidu • přímé působení sacharidu ? ? • signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry • signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry apoplastická invertáza apoplastická invertáza • hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace • hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace • obsah sacharidů se promítá do hladiny sacharidu se signálním potenciálem (trehalóza-6-P) nebo jiné signální molekuly (SnRK1) invertáza x SuSy invertáza x SuSy • Cukr může indukovat změny hladin fytohormonů (auxinů a cytokininů)

9. f) Doplňky Dodávají báze NK, NK, aminokyseliny, vitaminy, růstové regulátory … Extrakty : bramborový, kvasničný extrakt Tekuté endospermy: rajčatová šťáva, banánová šťáva, nejčastěji… kokosové mléko g) pH média- Pufry pH ovlivňuje rozpustnost solí pH ovlivňuje příjem látek z média (živin i hormonů) pH ovlivňuje gelační schopnosti agaru (pod pH 5 nedostatečná gelace) Stabilizace pH médií užitím organických pufrů h) Růstové regulátory Funkce nikoli nutriční, ale regulační Účinné ve velmi nízkých koncentracích. Ovlivňují současně velký počet rozdílných procesů. Nejdůležitější in vitro : auxiny, cytokininy, kys. abscisová, gibereliny SLOŽENÍ MÉDIÍ

10. SLOŽENÍ MÉDIÍ Auxin cytokininový model- tabák, Skoog a Miller, 1957 auxin Tvorba kořenů na řízcích Embryogeneze Tvorba adventivních kořenů v kalusu Iniciace kalusu Tvorba adventivních výhonů Proliferace úžlabních výhonů cytokinin • Rozhoduje: • endogenní hladina růstových regulátorů, která je výsledkem interakce endogenních hladin fytohormonů a exogenní aplikace růstových regulátorů. • volba vhodného fytohormonu a nebo růstového regulátoru s obdobným účinkem

11. SLOŽENÍ MÉDIÍ exprese genů účastnících se cytokininové signalizace exprese cytokininového receptoru CRE 1 syntézy cytokininů ? Analýza transkriptomu u Arabidopsis  exprese receptorů AHK3, AHK2 up-regulace transkripčních faktorů, transposonům příbuzných elementů, DNA- a chromatin modifikujících enzymů… změna asi 800 genů auxin Habituace Iniciace kalusu =tkáňová kultura po opakovaných pasážích ztrácí závislost na exogenním cytokininu Habituace je mitoticky přenosná vlastnost cytokinin ? mechanismus habituace ? Pravděpodobně NE reverzibilní  epigenetická komplexní změna

12. zlepšení kvality somatických embryí • zabránění předčasnému klíčení somatických embryí • regulace syntézy zásobních látek v embryích • synchronizace somatické embryogeneze • zvýšení desikační tolerance • navození klidového stádia při přípravě umělých semen ABA • zvyšuje stresovou toleranci • zpomaluje růst udržovacích kultur • snižuje transpiraci během aklimatizace rostlin ex vitro • zvyšuje frekvenci přežívajících explantátů po kryoprezervaci Rai et al., 2011

13. Př: Kořenění segmentů Cizrna WH +IBA 70% zakořeněných segmentů WH + 20 % -,,- ½ WH +IBA 47 % zakořeněných segmentů ½ WH + 46% -,,- SLOŽENÍ MÉDIÍ Interakce:minerální výživaXrůstové regulátory ??? optimální obsah minerálních složek média; ??? mohou minerální živiny částečně nahradit roli R.R. ??? mohou R.R. kompenzovat disbalanci v minerální výživě • Rozhoduje hlavně N a jeho forma : • Poměr HN4+: NO3- má vliv na : • dediferenciaci • růst • morfogenezi Důležitý také poměr N:cukr NIAA  N ABAGA N cytokinin N etylén

14. SLOŽENÍ MÉDIÍ Př: Kořenění segmentů: Leucopogon (extrém)  soli +  R.R 70% zakořeněných segmentů MS + NAA 38 % -,,- Př: Produkce adventivních výhonů: Jalovec MS + BA + NAA 9 % segmentů tvořících výhony HS + BA 18% -,,- Př: Produkce somatických embryí : Jasan MS + BA + NAA 17 % explantátů tvořících SE DKW +  20% -,,- i)Zpevňující složka Nejčastěji : agar (agaróza) Tvoří gel, taje při 100 °C a tuhne při  45 °C; není tráven rostlinnými enzymy, nereaguje se složkami médií ( ?? inertní ) XX Tekutá média – prámky, můstky, zavěšené kapky, „temporary immersion systems“.

16. ASEPTICKÁ KULTIVACE ASEPTICKÁ KULTIVACE • Sterilizace výchozího materiálu • Sterilizace médií, nástrojů • Detekce kontaminace • Citlivost kontaminujících organismů • Použití antibiotik • Sterilizace výchozího materiálu • Omytí ředěným roztokem detergentu • Omytí tekoucí vodou • Ošetření sterilizačním činidlem : NaClO, Ca(ClO)2 AgNO3, H2O2, HgCl2, EtOH • kontakt činidlo-sterilizovaný materiál (EtOH, smáčedlo, snížený tlak, míchání) • trvání sterilizace – krátké  nedostatečná sterilizace dlouhé  poškození rostlinných pletiv • koncentrace sterilizačního roztoku, vysoká X nízká • Závěrečné omytí sterilní vodou TeplotaSvětloVlhkostSložení plynné fázeSložení médiíAseptická kultivaceTyp explantátu Ošetření mateřských rostlin

17. ASEPTICKÁ KULTIVACE Sterilizace je úspěšná při co nejnižší výchozí hladině kontaminace  důležitý je výběr explantátu • části rostlin ve styku s půdou - silně kontaminovány • rostliny rostoucí za nízké rel. vlhkosti a nezalévané na list – málo kontaminovány • kontaminace se mění výrazně v závislosti na ročním období • úspěch jen když vnitřní pletiva jsou prosta kontaminace • Sterilizace médií, nástrojů • autoklávování – 120 °C; 0,1 MPa, doba sterilizace závisí na objemu média. • ( pokles pH o 0,3-0,5 ) • filtrace – skleněné frity, membránové filtry • suché teplo – 3h 150 °C •  - radiace, páry kys. peroctové

18. ASEPTICKÁ KULTIVACE • Detekce kontaminace • viditelný růst • latentní kontaminace zpomalený růst, špatné zakořeňování, náhlý úhyn rostlin po • mnoha subkultivacích  kontaminace napadá pletiva, snižuje pH, • vyčerpává živiny, produkuje fytotoxické látky detekce – přeočkování na různé půdy - někdy lze detekovat jen sérologicky nebo e- mikroskopií • Citlivost kontaminujících organismů • většina kontaminací nepřečká běžné sterilizační postupy • ale !! Někdy velká odolnost: rod Bacillus : 5 min ponoření do EtOH, opálení lihovým • kahanem, ale i 1 týden v EtOH, i 20 min při 110 °C, výjimečně 20 min při 120 °C. • Použití antibiotik • nemají nahradit pečlivost aseptické práce ! • některá antibiotika podporují růst • častěji – fytotoxicita - antibiotika, která interferují se syntézou DNA, RNA • působí i na eukaryota; výhodné pokud specificky působí na mikroorganismy • nejlépe znát citlivost kontaminujícího mikroorganismu • antibiotika působí na aktivně rostoucí organismy • rezistence

19. Genotyp: Dvouděložné Nejlépe reagují: Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Brassicaceae Jednoděložné Nahosemenné Stáří: a) stáří jedince „skutečné stáří“--- počet dní od vyklíčení rostliny „fyziologické stáří“----fáze růstu a vývoje rostliny b) relativní stáří pletiva c) u již založené kultury in vitro rozhoduje subkultivační interval (hodnocení velmi obtížné např.: Vzrostný vrchol z 50 let staré rostliny v juvenilním stavu je „ mladý“. U dřevin nejlepší výsledky s výhony u báze kmene) • Většinou nejvhodnější explantát z nově založených orgánů • Méně často - z plně vyvinutých orgánů • V některých případech jen změna postupu morfogeneze: • explantát z mladých listů nejprve koření • z dospělých listů nejprve tvoří pupeny TeplotaSvětloVlhkostSložení plynné fázeSložení médiíAseptická kultivaceTypexplantátu Ošetření mateřských rostlin TYP EXPLANTÁTU

20. -- příliš malý explantát  velké hynutí, ---- malé zásoby živin, hormonů,  poměr poraněná : neporaněná část povrchu,  produkce etylénu -- příliš velký explantát  špatná manipulace, horší styk s médiem, malý množitelský efekt Velikost explantátu třeba zvolit optimální Polarita explantátu !! vhodné umístění vzhledem k médiu, zachovaná polarita včetně směru transportu látek

21. TeplotaSvětloVlhkostSložení plynné fázeSložení médiíAseptická kultivaceTyp explantátu Ošetření mateřských rostlin OŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLIN • Stav rostlin: zdravé, aktivně rostoucí, bez stresu, dostatek živin • Termín odběru: změny v teplotě, fotoperiodě, osvětlení  hladiny cukrů, proteinů, R.R • Dormance: většinou aktivně rostoucí, ne vždy ! • Př:tvorba náhradních pupenů na kořen. řízcích dřevin --- jen z dormantních rostlin • Působení teploty: teplota při kultivaci mateřské rostliny ovlivňuje chování explantátu Př:% vytvořených pupenů slivoně je úměrné době udržování mat.r. při 4°C • Působení světla: promítá se do hladin zásobních látek, R.R.  změny v chování explantátu • Působení R.R: ovlivňuje jak růst, tak morfogenezi Př:rajče, ošetření chlormequatem (inhibice syntézy giberelinů)  zvýšení tvorby pupenů na listových explantátech