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细胞免疫治疗的临床应用

细胞免疫治疗的临床应用. 东莞东华医院 吴远军 主任技师. 细胞治疗相关研究的重大突破. 1967 年，将正常人 骨髓移植 到病人体内治疗造血功能障碍 . 1990 年 , 器管和细胞移植技术 获诺贝尔生理学与医学奖 . 1998 年，从人类胚胎组织 分离胚胎干细胞 . 1999 年， 发现干细胞具有自我更新和多向分化潜能 . 1999 年， 《Science》 将 干细胞研究 评为当年 十大科学进展首位 ，而耗资巨大的 人类基因组工程屈居第二 . 2000 年， 干细胞的研究 再次被 《Science》 评为 十大科学进展 之一.

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细胞免疫治疗的临床应用

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  1. 细胞免疫治疗的临床应用 东莞东华医院 吴远军 主任技师

  2. 细胞治疗相关研究的重大突破 • 1967年，将正常人骨髓移植到病人体内治疗造血功能障碍. • 1990年,器管和细胞移植技术获诺贝尔生理学与医学奖. • 1998年，从人类胚胎组织分离胚胎干细胞. • 1999年，发现干细胞具有自我更新和多向分化潜能. • 1999年，《Science》将干细胞研究评为当年十大科学进展首位，而耗资巨大的人类基因组工程屈居第二. • 2000年，干细胞的研究再次被《Science》评为十大科学进展之一.

  3. 2006 年，Yamanaka 实验室利用Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 4 种因子将鼠成纤维细胞重编程为诱导多功能干细胞（iPSc）. • 2007年，美、英两国的3位科学家因在干细胞研究方面的卓越贡献，获得诺贝尔生理学与医学奖. • 2011年，加拿大、美国和卢森堡的3位科学家因发现树突状细胞，并阐明了树突状细胞在细胞免疫中的作用机制而获得诺贝尔生理学与医学奖. • 近6年来，诱导多能干细胞的重大进展进一步将干细胞研究推向了生物医药领域的前沿. • 2012年，日、英2位科学家因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献 ，获得诺贝尔生理学与医学奖.

  4. 输血与细胞治疗的关系 • 输血医学的发展史也是细胞治疗技术的发展史。 • 输血（含血细胞）是最早应用、也是目前最常用的细胞治疗技术。 • 有学者将现已应用的细胞治疗技术分为3代： • 第一代：输血（含血细胞）； • 第二代：未经体外处理（纯化、扩增）的骨髓或外周血中的单个核细胞移植（所谓的造血干细胞细胞移植）； • 第三代：经体外纯化、扩增、诱导分化等处理的干细胞及免疫细胞治疗。 • 细胞治疗与再生医学是输血专业的重要发展方向。

  5. 东莞东华医院细胞生物治疗实验室建设 东莞东华医院细胞生物治疗实验室(隶属输血科) • 正、副高级专业技术人员各一名 • 符合GMP要求的百级层流实验室 • 美国COBE Spectra血细胞分离机 • 德国Thermo Scientific BB15型细胞培养箱（3台） • 日本KUBOTA 5922型大容量水平低温离心机 • 日本OLYMPUS CKX-41-A32PH倒置显微镜 • 日本SANYO MDF-382E超低温冰箱（-80℃） • 百级超净工作台等其他配套设备。

  6. 细胞治疗实验室可开展的主要技术项目 • 干细胞治疗技术(目前限制开展） • 骨髓干细胞的分离、纯化及骨髓间充质干细胞的扩增 • 脐血干细胞的分离、纯化 • 脐带间充质干细胞的分离及扩增 • 脂肪间充质干细胞的分离及扩增 用于组织修复及受损器官功能重建 ——再生医学 我们相信：待国家统一的规范发布以后，干细胞治疗将会得到更加规范、有序、健康地发展！

  7. 体细胞免疫治疗技术(鼓励开展) • 树突状细胞(DC)诱导培养 • 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)诱导培养 • DC-CIK细胞联合培养 通过提高机体免疫监视及免疫杀伤效应，增强机体免疫力，用于肿瘤及病毒感染性疾病的治疗。 已开展的CIK及DC-CIK细胞治疗技术，产品质量达到目前公认的最高质量要求，经10个月来的临床应用表明本室CIK及DC-CIK细胞治疗安全有效。

  8. 东莞东华医院细胞生物治疗中心百级层流实验室东莞东华医院细胞生物治疗中心百级层流实验室

  9. 体细胞免疫治疗技术：是指从自体外周血液（每次采集50ml）或异体血液（如脐血）中分离单个核细胞经过体外激活和扩增为具有免疫效应的细胞后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。体细胞免疫治疗技术：是指从自体外周血液（每次采集50ml）或异体血液（如脐血）中分离单个核细胞经过体外激活和扩增为具有免疫效应的细胞后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。 • 目前较常应用的是DC和CIK

  10. 树突状细胞（DC）

  11. 树突状细胞是目前所知机体内功能最强，也是唯一可激活初始T细胞的专职抗原提呈细胞（APC），是机体免疫应答的始动细胞。树突状细胞是目前所知机体内功能最强，也是唯一可激活初始T细胞的专职抗原提呈细胞（APC），是机体免疫应答的始动细胞。 • 从外周血或脐血中分离的MNCs经贴壁培养获得的细胞群，可在体外诱导培养为大量的DC，再经体外负载肿瘤抗原后，成为特异性DC相关肿瘤疫苗。 • 在肿瘤患者体内，DC负责TAA的摄取、加工并交叉提呈给初始T淋巴细胞，继而刺激初始T淋巴细胞大量增殖，产生记忆性T淋巴细胞，并通过以下机制起到抗肿瘤作用：

  12. DC诱导初始T细胞活化产生CTL(CD8+T细胞/ CD4+T细胞)，活化的CTL通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞。 • DC激活NK细胞杀伤肿瘤细胞。 • DC直接杀伤作用。

  13. 加拿大、美国和卢森堡的三位科学家因发现树突状细胞，并阐明了树突状细胞在细胞免疫中的作用机制而获得2011年诺贝尔生理学及医学奖加拿大、美国和卢森堡的三位科学家因发现树突状细胞，并阐明了树突状细胞在细胞免疫中的作用机制而获得2011年诺贝尔生理学及医学奖

  14. DC（负载抗原疫苗）制备流程

  15. 本实验室诱导培养的树突状细胞(未负载抗原)

  16. DC的应用研究 • 肿瘤细胞抗原致敏DC:用肿瘤特异性抗原（TSA）和肿瘤相关抗原（TAA）负载DC制备肿瘤疫苗，回输患者用于肿瘤的治疗。 • DC与肿瘤细胞融合：利用聚乙二醇、电穿孔技术将DC与肿瘤细胞融合制备成融合细胞瘤苗，保留肿瘤细胞所有抗原，又保留DC的抗原提呈和激活T细胞的功能，可有效诱导抗肿瘤免疫。 • 基因修饰DC:用肿瘤相关抗原基因和细胞因子基因修饰DC,比抗原肽或肿瘤细胞碎片直接致敏的DC抗原提呈作用更强，持续时间更长。 • 目前临床应用主要是用DC(负载或不负载肿瘤抗原)刺激细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）用于肿瘤及病毒感染性疾病的治疗。

  17. 细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）

  18. CIK（cytokine-induced killer）细胞：1991年美国斯坦福大学Schmidt Wolf等发现在多种细胞因子（IFN-Γ、CD3单抗、IL-1和IL-2）作用下，外周血中的单个核细胞可以被定向诱导并大量扩增成为具有抗肿瘤活性的细胞群。又称为自然杀伤样T淋巴细胞，具有NK细胞非主要组织相容性复合体限制性杀瘤特点和T淋巴细胞强大的抗瘤活性。

  19. 近年来随着CIK细胞诱导培养技术的逐渐成熟，体外培养增殖效率可达1000倍以上，细胞杀伤活性更强。近年来随着CIK细胞诱导培养技术的逐渐成熟，体外培养增殖效率可达1000倍以上，细胞杀伤活性更强。 • 已成为目前细胞免疫治疗中首选的治疗方案。 • CIK细胞群体中主要的效应细胞是CD3+、CD56+ T细胞，而T细胞是机体免疫系统实现细胞免疫和免疫调节的重要成分，特别是在抗病毒感染和对癌细胞的免疫监视上具有重要作用。

  20. CIK细胞的作用机制 • 对肿瘤细胞的直接杀伤作用：通过黏附因子LFA-1/ICAM-1途径与肿瘤细胞结合分泌大量的BLT酯酶颗粒，穿透靶细胞，导致肿瘤细胞裂解。 • 分泌IL-2、IL-6、IFN-Γ、TNF-α等细胞因子，一方面直接抑制肿瘤生长，另一方面通过调节免疫系统间接杀伤肿瘤细胞。 • 活化肿瘤细胞凋亡基因，诱导肿瘤细胞凋亡、坏死。

  21. CIK抗肿瘤作用的体外实验 CIK与肿瘤细胞混合起始时 CIK与肿瘤细胞混合培养12h后

  22. CIK对结肠癌模型的治疗效果

  23. CIK的临床应用研究 • 2005年，斯坦福大学Negrin课题组针对7例晚期霍奇金淋巴瘤及2例晚期非霍奇金淋巴瘤患者进行了CIK细胞治疗的Ⅰ临床实验。这9例患者均进行过造血干细胞移植治疗后复发。9例患者均接受3次，每次(0.1-1.0)×1010细胞数的自体CIK细胞回输治疗， 没有发生严重的副反应， CIK细胞回输治疗后2例PR、2例SD.

  24. Weng等针对85例肝癌患者进行肝动脉栓塞化疗及射频消融治疗后，再联用CIK细胞治疗，随访18个月发现患者的复发率与不联用CIK细胞治疗组相比显著下降。Weng等针对85例肝癌患者进行肝动脉栓塞化疗及射频消融治疗后，再联用CIK细胞治疗，随访18个月发现患者的复发率与不联用CIK细胞治疗组相比显著下降。 • Wu C等对59例晚期非小细胞肺癌患者采用多西紫杉醇或顺铂进行化疗后，再联用CIK细胞治疗，结果发现联用CIK细胞治疗组免疫功能指标、生活质量、疾病控制率及无疾病生存期均比单独化疗组有显著提高。

  25. 北京军区总医院联合第四军医大学西京医院，对32例经胸部影像学、组织病理学等方法确诊，根据国际抗癌联盟（UICC）分期标准为ⅢB-Ⅳ期的非小细胞肺癌患者，这些患者均经过2-4周期化疗显示为PD(进展)，并且放弃继续化疗。每例患者给予2-3疗程，每疗程给予(0.5-1.5)×1010细胞数的CIK细胞治疗。结果CR(完全缓解)4例，PR(部分缓解)6例，MR(轻度缓解)15例，SD(稳定)5例，PD(进展)2例。随访生存期为：1年生存率为80.4%，2年生存率为70.5%，3年生存率为49.8%。北京军区总医院联合第四军医大学西京医院，对32例经胸部影像学、组织病理学等方法确诊，根据国际抗癌联盟（UICC）分期标准为ⅢB-Ⅳ期的非小细胞肺癌患者，这些患者均经过2-4周期化疗显示为PD(进展)，并且放弃继续化疗。每例患者给予2-3疗程，每疗程给予(0.5-1.5)×1010细胞数的CIK细胞治疗。结果CR(完全缓解)4例，PR(部分缓解)6例，MR(轻度缓解)15例，SD(稳定)5例，PD(进展)2例。随访生存期为：1年生存率为80.4%，2年生存率为70.5%，3年生存率为49.8%。

  26. 苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心（国家自然科学基金项目）：选取1998年至2008年156例原发性胃癌手术治疗术后患者随机分为化疗组（单纯化疗）81例、CIK治疗组（化疗+CIK治疗）75例，CIK治疗组的化疗方案同化疗组，CIK治疗在化疗结束后进行，每例每月输注0.5 ×1010细胞数的CIK细胞，治疗3个月，共输注CIK细胞1.5 ×1010。在观察期内，CIK治疗组复发率为53.3%，化疗组复发率为71.6%；CIK治疗组中位生存期为49个月，化疗组中位生存期为27个月。

  27. 2012年2月3日中央电视台《走进科学》

  28. 北京解放军总医院专家对CIK临床研究的结论

  29. 体外诱导培养的CIK细胞 北京解放军总医院培养的CIK 本实验室培养的CIK

  30. DC-CIK细胞

  31. 将DC与CIK共培养，具有显著的协同抗肿瘤效应：DC能提高CIK的杀瘤特异性，CIK能促进DC表面共刺激分子表达增加，提高其抗原提呈能力。因此，现在树突状细胞刺激的细胞因子诱导杀伤细胞（DC-CIK）被临床广泛应用 。

  32. DC-CIK的抗肿瘤作用 • 能增强肿瘤患者机体的免疫功能。 • 能有效杀伤手术、化疗、放疗和微创治疗后机体内残存的肿瘤细胞，对于抑制肿瘤的复发和转移，提高肿瘤患者生活质量和延长生存期具有较好的作用。 • 可与肿瘤的手术、放疗、化疗和微创治疗相结合，作为肿瘤综合治疗的一部分，也可以作为肿瘤手术、放疗、化疗和微创治疗后的巩固治疗。

  33. DC-CIK细胞治疗的临床研究

  34. 解放军第208医院细胞移植中心：回顾性研究531例中晚期恶性肿瘤于手术及放、化疗后静脉输注DC—CIK细胞治疗的疗效。结果：解放军第208医院细胞移植中心：回顾性研究531例中晚期恶性肿瘤于手术及放、化疗后静脉输注DC—CIK细胞治疗的疗效。结果： • 客观缓解率(OR)： 531例中126例有可测量病灶，其中CR 6例，PR 53例，OR为47.8％ ；SD 62例(49.1％)；PD 5例(3.1％)。 • 临床受益率(CBR)： 390例患者可评价CBR：Kamofsky评分增加≥20分者占89．8％；疼痛减轻≥50％者占71.05％ ；胸腹水减少≥50％者占58.33％ ；体重量增加≥7％者占47.7％。总CBR为93.33％ 。对治疗前后患者Kamofsky评分进行统计学分析，治疗后Kamofsky评分为91.36±2.20，较治疗前(72.25±3.49)升高，并具有极显著性差异。 • 生存率：531例中Ⅲ-Ⅳ期358例，3年生存率为61.2％(219/358)

  35. 北京大学人民医院

  36. 北京道培医院血液科主任童春容教授： • 否定auto-HCT对白血病的治疗价值。 • 对白血病高危组：allo-HCT+免疫治疗。 • 对白血病低危组：化疗+免疫治疗。 ------2012细胞治疗技术研讨会，2012.6.1

  37. DC-CIK治疗的流程示意图

  38. 本实验室诱导培养的DC-CIK细胞

  39. 本实验室DC-CIK细胞表面标志物检测 CD3+细胞占79.9%， CD3+CD4+细胞占18.1%，CD3+CD8+细胞占56.9%

  40. 悬浮于NaCl注射液中的DC-CIK产品 本实验室DC-CIK产品

  41. 体细胞免疫治疗病例选择原则 • 体细胞免疫治疗可作为肿瘤综合治疗的一部分，也可作为肿瘤手术、化疗和放疗后的巩固治疗手段之一，对抑制肿瘤复发和转移具有较好的作用。对一些免疫原性较强的恶性肿瘤（如肾癌、恶性黑色素瘤、恶性神经胶质瘤）或对化疗和放疗不敏感肿瘤（如原发性肝癌）在手术或介入微创治疗后可直接接受细胞免疫治疗；通常在进行体细胞免疫治疗前，要降低肿瘤负荷；体细胞免疫治疗联合抗肿瘤的细胞因子、抗肿瘤抗体、分子靶向药物能取得更好的疗效；因此，肿瘤患者在综合治疗原则下辅以个体化的细胞免疫治疗，能取得更好的疗效。

  42. 体细胞免疫治疗病例选择标准 • 体细胞免疫治疗可作为肿瘤患者综合治疗的一部分，即联合手术、放疗、化疗的综合治疗； • 常规治疗方案（放疗、化疗、激素疗法、手术疗法）结束后的巩固治疗； • 对现有标准治疗方案（放疗、化疗、激素疗法、手术疗法）失败者； • 患者综合身体情况：生存质量卡式评分≥60%； • 患者血常规检测，WBC≥3×109/L，Hb≥80g/L，Plt≥50×109/L； • 患者凝血功能没有明显异常：凝血酶原活动度（PTA）＞50%； • 有患者或法定代理人签字的知情同意书。

  43. 体细胞免疫治疗病例排除标准 • 心脑血管疾病、严重高血压和糖尿病、肾功能不全或衰竭者； • 器官移植后长期使用免疫抑制剂的患者； • 正在使用免疫抑制药物的患者； • WBC＜3×109/L者； • 有严重贫血，Hb＜80g/L者； • Plt＜50×109/L者； • 凝血功能明显异常，凝血酶原活动度（PTA）＜50%者； • 有明确感染或发热的患者； • T细胞淋巴瘤，骨髓瘤患者； • 自身免疫性疾病患者； • HIV阳性或有其他免疫缺陷疾病的患者； • 孕妇； • 主要脏器功能不全患者。

  44. 体细胞免疫治疗的优势 • 有研究表明：恶性肿瘤手术和化疗后、白血病化疗后的微小残留病（MRD）是肿瘤或白血病复发的根源，MRD多为静止期的G0期细胞，化疗只对处于增殖期的细胞有杀伤作用，对处于静止期的细胞作用差。而CIK细胞能有效、特异性的杀伤G0期肿瘤细胞或白血病细胞，降低肿瘤或白血病的复发率。 • 体细胞免疫治疗是通过提高机体免疫力，调动机体免疫系统发挥抗肿瘤及抗病毒效应，几乎没有副作用。 • 体细胞免疫治疗在抗肿瘤的同时可明显提高患者的生存质量。 • 对肿瘤负荷轻的患者可达到根治的效果。

  45. 媒体对体细胞免疫治疗的报道

  46. 体细胞免疫治疗在国内的兴起 有希望 有前景

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