analytick f ze klinicko biochemick ho vy et en pacienta n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta PowerPoint Presentation
Download Presentation
Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 43

Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta - PowerPoint PPT Presentation


  • 127 Views
  • Uploaded on

Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta. Ing. Andrea Gruberová Doc. MUDr. Petr Č echák, CSc. Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV a 3 LF UK 2006/2007. Fáze laboratorního vyšetření :.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta' - nedra


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
analytick f ze klinicko biochemick ho vy et en pacienta
Analytická fáze klinicko - biochemického vyšetření pacienta

Ing. Andrea Gruberová

Doc. MUDr. Petr Čechák, CSc.

Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV

a 3 LF UK

2006/2007

f ze laboratorn ho vy et en
Fáze laboratorního vyšetření :
  • preanalytická - definována jako postupy a operace od požadavku na vyšetření až po zahájení analýzy vzorku, tj. skládá se z přípravy nemocného na odběr vyšetření, odběru biologického materiálu, jeho uchování a transportu do laboratoře
  • analytická - je prováděna v laboratoři v souladu s postupy správné laboratorní praxe - zahrnuje vnitřní a vnější kontrolu kvality, které by měly minimalizovat chyby analytického procesu
  • postanalytická - Jedná se o interpretaci výsledků stanovení ve vztahu k fyziologickým hodnotám (bývají udávány jako referenční meze), k výsledkům dalších vyšetření laboratorního komplementu a zobrazovacích metod a ke klinickému obrazu pacienta (anamnéze, objektivnímu nálezu)
analytick f ze laboratorn ho vy et en
Analytickáfáze laboratorního vyšetření
  • Jedná se o tu část laboratorního vyšetření, která je doménou laboratoře, tj. o vlastní analýzu.
  • Je zajišťována analytickými chemiky, biochemiky a zdravotními laboranty a prováděna v souladu s postupy správné laboratorní praxe (interní a externí kontrola kvality).
  • Stanovení daného analytu může být prováděno celou řadou metodik, tj. analytických postupů, které ovšem mohou mít různou vypovídací hodnotu. S rozvojem řady technologií v našem století se přesnost a spolehlivost metod výrazně zvýšila. Příkladem může být stanovování stopových prvků, kdy v průběhu dvaceti let normální hodnoty poklesly až stonásobně.
druhy biologick ho materi lu v laborato i
Druhy biologického materiálu v laboratoři :
  • sérum - nažloutlá tekutina, která vzniká po sražení krve (krevní buňky s některými bílkovinami vytvoří koagulum a s. je vytlačeno ven). Je podobné plasmě, ale neobsahuje některé bílkoviny, které jsou nutné ke vzniku sraženiny a které se při její tvorbě spotřebovaly
  • plasma - nažloutlá tekutina, která je spolu s krvinkami v ní obsaženými základem krve. Obsahuje 90 % vody, 8 % bílkovin (albumin, globuliny, fibrinogen, koagulační faktory, imunoglobuliny aj.), soli, glukosu, lipidy, žlučová barviva, hormony, vitaminy, odpadní látky aj.
  • - lze získat odstředěním nesrážlivé krve, tj. krve odebrané do stříkačky nebo zkumavky obsahující protisrážlivé látky – citrát nebo heparin
  • punktát – materiál získaný punkcí
  • moč
  • likvor
  • stolice
  • slzy
metody podle principu
Metody (podle principu) :
  • chemické
  • fyzikální
  • imunochemické
  • m. vyšetřování nukleových kyselin
  • chromatografické
metody chemick
Metody chemické :
  • optické
  • elektrochemické
  • elektroforetické
metody optick
Metody optické :
  • Absorpční fotometrie
    • zabývá se kvantitativním hodnocením změny intenzity záření po průchodu analytickým prostředím
    • absorbance je přímo úměrná látkové koncentraci a tloušťce absorbující vrstvy
    • platí Lambertův-Beerův-Bougnerův zákon : A = a . c . l

A . . . absorbance

a . . . absorpční koeficient pro danou λ (vlnová délka)

c . . . koncentrace roztoku

l . . . délka optické dráhy (tloušťka vrstvy roztoku)

- přístroje :

- jednopaprskové - absorpční fotometry

- dvoupaprskové roztok spektrofotometry

blank (slepá zkouška)

s rozvojem automatických analyzátorů výzkum

metody optick pokra ov n
Metody optické – pokračování :
  • Reflexní fotometrie– sleduje se odražené záření od homogenně zbarvené podložky

- použití : pro kvantitativní vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi se suchými činidly po jejich aktivaci vodou obsaženou v měřeném vzorku

  • Plamenová emisní fotometrie– měří se intenzita zbarvení plamene, k emisi záření charakteristické délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) na původní dráhy

použití : pro stanovení koncentrace sodných a draselných iontů v séru či v moči, lithia a vápníku

nátrémie - závislá na obsahu bílkovin a lipidů v plazmě kde se patologicky zvyšují falešně snížená nátrémie (tzv. pseudohyponátrémie)

metody optick pokra ov n1
Metody optické – pokračování :
  • Fluorimetrie– využívá se jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla vzniká fotoluminiscence; látky při tom vyzařují světlo, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci fluoreskující sloučeniny

Použití : zejména pro detekci v imunochemii

  • Turbidimetrie– založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích
        • měří se stupeň zákalu - turbidita

- použití : imunochemické metody

  • Nefelometrie– měření intenzity difuzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích
        • rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření

- použití : pro reakce antigen-protilátka, je o řád citlivější než turbidimetrie

metody optick pokra ov n2
Metody optické – pokračování :
  • Chemiluminiscence– excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po nástřiku syntetizovaného činidla, nebo se použije biologická substance (bioluminiscence) nebo se k excitaci činidel využívá oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence)
        • přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) světelná emise
elektrochemick metody
Elektrochemické metody :
  • Potenciometrie– měří se rozdíl potenciálů (napětí) mezi dvěma elektrodami; jedna elda – referenční (srovnávací) – konstantní potenciál; druhá elda – indikační (měrná) – potenciál závisí na aktivitě měřeného analytu ve zkoumaném vzorku

- použití : stanovení sodných, draselných, lithných, vápenatých, hořečnatých a amonných kationtů, chloridových aniontů a oxid uhličitý

- pH - astrup - skleněná elda

- ISE

  • Ampérometrie– měření proudu za konstantního potenciálu

- amperometr slouží jako detektor elektronů v oxidačně-redukčních reakcích při stanovení glukozy, sleduje se množství elektronů uvolněných při doprovodné reakci

Fe2+ Fe3+ + e- všechny moderní glukometry

elektrochemick metody pokra ov n
Elektrochemické metody - pokračování :
  • Polarografie– měří se intenzita proudu při konstantním vnějším potenciálu (přepětí)

Clarkova Elda – slouží ke stanovení množství kyslíku; kyslík rozpuštěný ve vzorku nebo v pufru difunduje přes hydrofobní membránu propustnou pro plyny ke katodě (z platiny), jako anoda slouží Ag/AgCl elda; použití u acidobazických analyzátorů k měření parciálního tlaku kyslíku

  • Coulometrie– ke stanovení koncentrace v roztoku se používá měření prošlého náboje při elektrochemické reakci

- použití : Stanovení chloridů, ale většinou se neužívá, vyžaduje separátní zpracování vzorku (na Cl- se používá spíše fotometrické stanovení)

  • Konduktometrie– založená na měření vodivosti analyzovaného roztoku, měří se vodivost mezi dvěma platinovými elektrodami

- elektrická vodivost roztoku závisí na koncentraci iontů, jejich pohyblivosti, disociaci a teplotě roztoku

- použití : pro stanovení močoviny a hematokritu a zejména pro sledování čistoty destilované vody

elektroforetick metody
Elektroforetické metody :
  • Zónová elektroforeza– založena na rozdílu pohyblivosti částic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul a vlastnostech prostředí

- jako nosič se využívá acetylcelulóza nebo různé gely (agarový, agarózový nebo polyakrylamidový)

- dělení na acetylcelulózových, agarových a agarózových fóliích – dochází k distribuci podle velikosti náboje; po ukončení dělení se jednotlivé složky fixují a barví; pak se fólie odbarví, popř. zprůsvitní a vysuší

- dělení na polyakrylamidovém gelu – látky se dělí nejen podle elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul; efekt molekulového síta – polyakrylamidový gel s gradientem hustoty, přidá se laurylsíran sodný (SDS) a všechny molekuly mají téměř stejný náboj a dělí se jen podle velikosti

- vyhodnocení – provádí se na denzitometru – elektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky; v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření; to se projeví při jeho dopadu na čidlo a převodu signálu na analogový záznam; po zpracování integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých elektroforetických frakcí

- použití : ke stanovení frakcí bílkovin, lipoproteinů, glykoproteinů a jednotlivých izoenzymů

fyzik ln metody
Fyzikální metody :
  • Osmometrie– měření osmolality v séru a moči

- osmotický tlak – tlak rozpuštěných, zejména nízkomolekulárních látek a iontů v roztoku odděleném polopropustnou membránou od samotného rozpouštědla

- přímo úměrný celkovému počtu rozpuštěných nebo disociovaných částic

- pokud látka disociuje každá disociovaná část je osmoticky aktivní částicí

- nedisociovaná látka - jen jedna osmoticky aktivní částice

- osmolalita (mmol/kg)– látková koncentrace osmoticky aktivních částic v 1 kg rozpouštědla

- orientační výpočet osmolality :

osmolalita = 2 [Na+]+[močovina]+[glukóza]

fyzik ln metody pokra ov n
Fyzikální metody - pokračování :
  • Onkometrie
      • onkotický tlak - koloidně osmotický tlak plazmatických bílkovin
      • v kPa
      • onkometry v KB - použití vzácně, většinou součástí přístrojové výbavy jednotek intenzivní péče a ARO
chromatografick metody
Chromatografické metody :
  • Chromatografie na tenkých vrstvách– využívá se principu rozdělovací, adsorpční, ionexové i afinitní chromatografie

- vzorky se nanášejí pipetou na hliníkovou fólii s litým silikagelem nebo oxidem hlinitým a vyvíjí se v chromatografické komoře v soustavě rozpouštědel

          • v klinické biochemii se používá méně než v minulosti a dává se přednost exaktnějším metodám
  • Plynová chromatografie– mobilní fáze je plynná a také separované složky jsou v plynném stavu

- stacionární fáze může být tuhá látka (separace na principu adsorpce nebo sítového efektu) nebo kapalina zakotvená na nosiči (rozděluje se složka mezi kapalnou stacionární a plynnou mobilní fázi)

- stacionární fáze v obou případech působí selektivně na jednotlivé separované látky a na základě vzájemných interakcí dochází k rozdělení (retenci, zadržování) jednotlivých složek v koloně k jejich rozdílné eluci

- rozdělené složky jsou unášeny nosným plynem z kolony a jejich množství je zaznamenáváno detektorem

chromatografick metody pokra ov n
Chromatografické metody - pokračování :
  • Kapalinová chromatografie– mobilní fáze je kapalná
        • v chromatografických kolonách
        • látky se dělí ve dvoufázovém dělícím systému na základě adsorpce, výměny iontů, fyzikální distribuce látek mezi kapalnou mobilní a s ní nemísitelnou kapalnou stacionární fází nebo na principu pronikání molekul z mobilní fáze do pórů tuhých částic, které mají funkci molekulového síta
metody imunochemick
Metody imunochemické :
  • založeny na principu reakce antigen – protilátka
  • Protilátka se váže na antigen biospecifickou vazbou
  • Antigen – vysokomolekulární látka, která je schopná vyvolat v živém organismu imunitní odpověď, namířenou specificky proti použitému antigenu

- bílkoviny, glykoproteiny, polysacharidy a lipopolysacharidy, nukleotidy

  • Protilátky (imunoglobuliny) – bílkoviny, vykazující specifickou vazebnou aktivitu vůči antigenu, na jehož podnět se v organismu vytvořily

- jejich úkol – chránit organismus proti infekci

- glykoproteiny

metody vy et ov n nukleov ch kyselin
Metody vyšetřování nukleových kyselin :
  • založeny na studiu DNA (resp. RNA)
  • Metoda PCR – polymerázová řetězová reakce
    • pomocí ní měříme několik kopií některé DNA sekvence lidského genomu amplifikací

pomnožení, mnohonásobné kopírování

- proces, kdy z několika málo kopií jedné molekuly (sekvence nukleotidů) získáme milion- i vícenásobek

metody
Metody :
  • kvalitativní- drogy, těhotenské testy

princip sendvičové analýzy

  • kvantitativní
  • semikvantitativní– vypovídá už také o množství hledané látky

- hodnocení - pomocí arbitrálních jednotek (0, 1, 2, 3, 4)

- hodnocení na kříže

- interval ohraničený kvantitativními hodnotami koncentrace

- obvykle subjektivní vizuální hodnocení

- nejčastěji proužky, zkumavky, jamky mikrotitračních destiček, plotny pro tenkovrstevnou chromatografii, jednoúčelné zkumavky, sklíčka …

- detekce - oko, mikroskop, reflexní fotometrie, infračervená spektrofotometrie, kapilární elektroforéza atd.

jednotky v klinick biochemii
Jednotky v klinické biochemii :

Mezinárodní soustava jednotek SI – přijata v roce 1977

Použití jednotek:

většina analytů – v látkové koncentraci (mmol/l, mikromol/l,nmol/l)

všechny bílkoviny – v hmotnostní koncentraci (g/l, mg/l)

hemoglobin – v hmotnostní koncentraci (g/l)

enzymová aktivita – mikrokat/l, nkat/l

parciální tlaky pO2 a pCO2 – kPa

rozd len vy et ovac ch metod
Rozdělení vyšetřovacích metod
  • „Mokrá chemie“ – reakce dvou roztoků
  • „Suchá chemie“ – reakce na tzv. stripu
such chemie1
„Suchá chemie“
  • kolorimetrie

rozdělovací vrstva

reakční vrstva

semipermeabilní membrána

detekční vrstva

nosná vrstva

slide28
potenciometrie

iontově-selektivní membrána

referenční vrstva

elektroda Ag/AgCl

slide29
imunologie

rozdělovací vrstva

reakční vrstva

gelová vrstva

nosná vrstva

metody stanoven glukozy
Metody stanovení glukozy
  • MS s izotopovým zřeďováním
  • Hexokinásová metoda (referenční metoda)
  • Glukosaoxidasová metoda
  • Glukosadehydrogenasová metoda
  • Elektrochemické metody
1 ms s izotopov m z e ov n m
1. MS s izotopovým zřeďováním
  • ke vzorku se přidá známé množství glukozy, značené uhlíkem 14C
  • složitým způsobem se provede derivatizace glukozy
  • těkavý derivát se separuje plynovou chromatografií
  • hmotnostní spektrometrií se určí poměr glukozy 12C a 14C
  • z poměru izotopů a známého přídavku lze určit koncentraci glukozy ve vzorku
  • vyžaduje speciální vybavení
  • trvá 2 dny
  • nejblíže se dělá v Německu
2 hexokin zov metoda
2. Hexokinázová metoda
  • katalýzy hexokinásou : fosfátová skupina z ATP se váže na glukozy
  • katalýza glukosa-6-fosfátdehydrogenasou : oxidace glukosa-6-fosfátu na 6-fosfoglukonát

- oxidační činidlo NADP+ se přitom redukuje na NADPH2 růst absorbance při 340 nm

  • referenční metoda
  • vysoká specifita reakce
  • stanovení ruší hemolýza a léčiva absorbující v UV
3 glukosaoxidasov metoda
3. Glukosaoxidasová metoda
  • ß-D-glukosa je oxidována FAD na 5-glukonolakton za katalýzy glukosaoxidasou
  • redukovaná forma FADH2 se vzdušným kyslíkem samovolně oxiduje zpět na FAD a O2 se redukuje na H2O2
  • vznikající 5-glukonolakton samovolně hydrolyzuje na kyselinu glukonovou
  • Trinderova reakce – POD katalyzuje oxidaci různých chromogenních akceptorů peroxidem vodíku
  • zbarvení obvykle červené
  • nejpoužívanější reakce v českých zemích
4 glukosadehydrogenasov metoda
4. Glukosadehydrogenasová metoda
  • glukoza se může oxidovat na 5-glukonolakton také pomocí NAD+ za katalýzy glukosadehydrogenasou
  • oxidační činidlo se redukuje na NADH2 odpovídající přírůstek absorbance se sleduje při 340 nm
  • v česku se nevyužívá, v USA ano
5 elektrochemick metody
5. Elektrochemické metody
  • úbytek O2 při oxidaci glukosy v přítomnosti GOD a katalasy lze sledovat polarograficky Clarkovou kyslíkovou elektrodou (analyzátory Beckman)
  • využití enzymové elektrody s imobilizovanou GOD na elektrodové membráně (analyzátory Eppendorf)
vztah mezi koncentrac aktivitou a sign lem
Vztah mezi koncentrací/aktivitou a signálem
  • Koncentrace – vyjadřuje se v hmotnostních nebo objemových jednotkách
  • Aktivita – definovaný účinek za definovaných podmínek
  • Matematický vztah – jednoznačný a za definovaných podmínek stejný

analysa je možná – užití standardů a kontrol

kalibrace a kontroly
Kalibrace a kontroly
  • Kalibrace – standardy opřené o referenční metody stanovení obsahu
  • Kontroly – analysované referenčními metodami nebo standardisovanými metodami na více pracovištích
  • Kalibrace a kontroly – stejné chování jako měřené vzorky
statistika v anal ze
Statistika v analýze :
  • Průměr
  • Rozptyl
  • Standartní směrodatná odchylka
  • Chyby měření :

- hrubé - vznikají selhání pracovníka nebo přístroje nebo použitím nevhodné metody analýzy

- vznikají obvykle jednorázově v důsledku vyjímečné příčiny

- systematické - soustavné, s konkrétní předvídatelnou příčinou

- stálý charakter, známá příčina

- náhodné - zcela nepravidelně, v důsledku působení náhodných vlivů

- ovlivňují přesnost výsledku

  • Správnost
  • Přesnost
  • Systém kontroly kvality (vnitřní a vnější) – další seminář
v voj v analytick chemii
Vývoj v analytické chemii
  • Eliminace vlivu ruční práce na výsledek měření
  • Programové automaty s využitím PC
  • Metody standardisované, referenční
  • Standardy opřené o referenční materiály/metody
  • Kontrolní laboratorní systém se opírá o vhodné kontrolní materiály (fy Bio-Rad, SEKK, Instand)
  • Dokumentace metod - SOP
v stup v sledk
Výstup výsledků :
  • - přepis ze sešitu do LIS
  • - přenos on-line z přístrojů do LIS
  • Kontrola a editace výsledků LIS, NIS
  • Dynamické sledování výsledků
  • Papírová dokumentace – pro lékaře

- pro laboratoř – hlavní kniha, pracovní listy a sešity, výtisky

archivace dat