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Etablierung neue Gene

Etablierung neue Gene. 1. Block-PCR 14.03.09 Annealing: 54°C; MgCl 2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM. Gelbild. CK20 1005 wegschneiden. Gradienten-PCR 15.03.09 55  5°C (50°C, 51,5°C, 53°C, 54°C, 55,5°C, 58°C, 60°C) UCA1: 3+4mM MgCl 2 : 5637 (1:3) (3  alte 5637)

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Etablierung neue Gene

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Presentation Transcript

  1. Etablierung neue Gene 1. Block-PCR 14.03.09 Annealing: 54°C; MgCl2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM Gelbild CK20 1005 wegschneiden Gradienten-PCR 15.03.09 55 5°C (50°C, 51,5°C, 53°C, 54°C, 55,5°C, 58°C, 60°C) UCA1: 3+4mM MgCl2: 5637 (1:3) (3 alte 5637) CK20: 4mM: 5637(1:2); EJ28+J82+RT4(1:2) nur 54°C;5mM: 5637 (1:2) Gelbild CK20 nur in RT4 Block-PCR (GA 20µl) 16.03.09 55°C, 3+4mM MgCl2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) Gelbild CK20 1005 wegschneiden Block-PCR (GA 50µl) 19.03.09 (für Gelelution) 56°C, 3mM MgCl2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) ? Gelbild

  2. Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren Klone picken CK20: 2; UCA1: 4 Plasmidpräp und DNA-Konz.-Bestimmung (Photometer) CK20: 148+163ng/µl 5µl UCA1: 28+20+65/ 128ng/µl  7,9/ 5µl Kontrollverdau 29.03.07 (NotI, PK DE-A) Gelbild Nicht geklappt, nur PK Agilent (DNA) 18.04.07 ??? Block-PCR mit Klonen 30.03.07 Programm wie GA 50µl Gelbild UCA1 gut, CK20 nicht ok, weil 5637 falsches template Agilent (DNA) 18.04.07 ??? CK20=0 ; UCA1=4,8ng/µl Block-PCR mit neuen Klonen 17.04.07 Für CK20, RT (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild ok

  3. Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren 10 Klone picken Plasmidpräp+Konz.-Bestimmung am Photometer 32,5-55ng/µl kein KV!!! Kontroll-Block-PCR mit 10 Klonen 27.04.07 RT4 (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild PK+NK gleich?! Sequenzierung UCA1 2+4; CK20 1+9 UCA1 schlecht; CK20 ok CK20 UCA1 01 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 01CK20 Test Plasmid 1 LC-PCR 08.05.07 EJ28 (?:?), Kapillarcycler, Klon 1(nicht sequenziert, aber Block-Fragment ok), Klon 4 (sequenziert  Fragment nicht drin), Annealing ? LC-PCR mit 3 Kits 08.05.07 RT4 (1:5), LC480, Klon 1 (Standardverdünnungsreihe 10e6-25), Annealing 56°C 10s (gleich ok gewesen  endgültiges Programm LC-Bild CP bei allen 3 Kits gleich (480 Probes Master etw.später als TaqManMAster); PM+TMM höhere Fluoreszenz als DNA-HP-Master LC-Bild Nur in EJ28  Ursache nicht diePrimer + Sonden, sondern Klonierung TMM

  4. Gelbild Keine Doppelbanden Oncoray TA-Vektor, 10 Klone Matrix-Test für Beschichtung (virale DNA) Gelbild Klonierungs-PCR Alle 10 Klone ok Gelbild Keine Doppelbanden bei bd. Matrices  Ausschluss falsche Rkt. 1-2 Standards, NK, PK Animpfen von 5 Klonen (1-2-8-9-10) 02 CK20 Test Plasmid 1 LC-PCR mit versch. ZL,Urinen, TURBT-Gewebe (RT4, RT 112, J82, EJ28, 5637, HT1376, HT1197) Gelbild Kontrollverdau 21.09.07 EcoRI, 8,5µl DNA H10 Gelbild ok Keine Doppelbanden Viele Probleme mit Elution! GFX!!! Sequenzierung Klon 1+10 ok LC-Bild CP: Urin 24-36; Gewebe 27-40; ZL 27-40 spät CP 21 als Beginn (entspr.10e5); 10e3,10e3,500 GVO 450 08 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 LC-PCR mit 3 Kits+ABI-Kits+ ? 21.09.07 ABI: Universal PCR MM NoAmp Erase, TaqMan Gene Expression Kit;EJ28 (1:5), LC480, Klon 1 (GFX-Kit; c62,5ng/µl, Standardverdünnungsreihe 10e6-?), Annealing ? (gleich ok gewesen  endgültiges Programm Beschichtung Platten+LC GVO 449 LC-PCR PK+NK+Standards LC-Bild CP: ? TMM+480 Probes Master ok

  5. } GELBILD • 1.Block-PCR • Gradienten-PCR • Block-PCR (GA 20µl) • Block-PCR (GA 50µl) • ... • KV (CK20 5µl!) GELBILD (5 Klone) UCA1 als Bsp. • Sequenzierung • LC-PCR mit 3 Kits (bei UCA1 auch nur diese 3 anzeigen?!) + Gelbild • CK20: LC-PCR mit versch. ZL • GVO 449+450 • Beschichtung für CK20 (SP6T7)  Agilentbild (Erklärung!!!) • Kontroll-PCR

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