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Optimization of Gene Establishment Techniques: Block PCR and Gradient PCR Analysis

This document outlines the experimental protocols and results for the establishment of new genes, specifically focusing on Block PCR and Gradient PCR methodologies conducted between March and April 2007. The aim was to optimize conditions such as MgCl2 concentration and annealing temperatures for efficient amplification of CK20 and UCA1 genes in various cell lines. Results include gel images, plasmid preparations, concentration determinations, and sequencing outcomes, highlighting successful cloning efforts and challenges faced during the elution and ligation processes.

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Optimization of Gene Establishment Techniques: Block PCR and Gradient PCR Analysis

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Presentation Transcript

  1. Etablierung neue Gene 1. Block-PCR 14.03.09 Annealing: 54°C; MgCl2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM Gelbild CK20 1005 wegschneiden Gradienten-PCR 15.03.09 55 5°C (50°C, 51,5°C, 53°C, 54°C, 55,5°C, 58°C, 60°C) UCA1: 3+4mM MgCl2: 5637 (1:3) (3 alte 5637) CK20: 4mM: 5637(1:2); EJ28+J82+RT4(1:2) nur 54°C;5mM: 5637 (1:2) Gelbild CK20 nur in RT4 Block-PCR (GA 20µl) 16.03.09 55°C, 3+4mM MgCl2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) Gelbild CK20 1005 wegschneiden Block-PCR (GA 50µl) 19.03.09 (für Gelelution) 56°C, 3mM MgCl2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) ? Gelbild

  2. Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren Klone picken CK20: 2; UCA1: 4 Plasmidpräp und DNA-Konz.-Bestimmung (Photometer) CK20: 148+163ng/µl 5µl UCA1: 28+20+65/ 128ng/µl  7,9/ 5µl Kontrollverdau 29.03.07 (NotI, PK DE-A) Gelbild Nicht geklappt, nur PK Agilent (DNA) 18.04.07 ??? Block-PCR mit Klonen 30.03.07 Programm wie GA 50µl Gelbild UCA1 gut, CK20 nicht ok, weil 5637 falsches template Agilent (DNA) 18.04.07 ??? CK20=0 ; UCA1=4,8ng/µl Block-PCR mit neuen Klonen 17.04.07 Für CK20, RT (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild ok

  3. Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren 10 Klone picken Plasmidpräp+Konz.-Bestimmung am Photometer 32,5-55ng/µl kein KV!!! Kontroll-Block-PCR mit 10 Klonen 27.04.07 RT4 (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild PK+NK gleich?! Sequenzierung UCA1 2+4; CK20 1+9 UCA1 schlecht; CK20 ok CK20 UCA1 01 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 01CK20 Test Plasmid 1 LC-PCR 08.05.07 EJ28 (?:?), Kapillarcycler, Klon 1(nicht sequenziert, aber Block-Fragment ok), Klon 4 (sequenziert  Fragment nicht drin), Annealing ? LC-PCR mit 3 Kits 08.05.07 RT4 (1:5), LC480, Klon 1 (Standardverdünnungsreihe 10e6-25), Annealing 56°C 10s (gleich ok gewesen  endgültiges Programm LC-Bild CP bei allen 3 Kits gleich (480 Probes Master etw.später als TaqManMAster); PM+TMM höhere Fluoreszenz als DNA-HP-Master LC-Bild Nur in EJ28  Ursache nicht diePrimer + Sonden, sondern Klonierung TMM

  4. Gelbild Keine Doppelbanden Oncoray TA-Vektor, 10 Klone Matrix-Test für Beschichtung (virale DNA) Gelbild Klonierungs-PCR Alle 10 Klone ok Gelbild Keine Doppelbanden bei bd. Matrices  Ausschluss falsche Rkt. 1-2 Standards, NK, PK Animpfen von 5 Klonen (1-2-8-9-10) 02 CK20 Test Plasmid 1 LC-PCR mit versch. ZL,Urinen, TURBT-Gewebe (RT4, RT 112, J82, EJ28, 5637, HT1376, HT1197) Gelbild Kontrollverdau 21.09.07 EcoRI, 8,5µl DNA H10 Gelbild ok Keine Doppelbanden Viele Probleme mit Elution! GFX!!! Sequenzierung Klon 1+10 ok LC-Bild CP: Urin 24-36; Gewebe 27-40; ZL 27-40 spät CP 21 als Beginn (entspr.10e5); 10e3,10e3,500 GVO 450 08 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 LC-PCR mit 3 Kits+ABI-Kits+ ? 21.09.07 ABI: Universal PCR MM NoAmp Erase, TaqMan Gene Expression Kit;EJ28 (1:5), LC480, Klon 1 (GFX-Kit; c62,5ng/µl, Standardverdünnungsreihe 10e6-?), Annealing ? (gleich ok gewesen  endgültiges Programm Beschichtung Platten+LC GVO 449 LC-PCR PK+NK+Standards LC-Bild CP: ? TMM+480 Probes Master ok

  5. } GELBILD • 1.Block-PCR • Gradienten-PCR • Block-PCR (GA 20µl) • Block-PCR (GA 50µl) • ... • KV (CK20 5µl!) GELBILD (5 Klone) UCA1 als Bsp. • Sequenzierung • LC-PCR mit 3 Kits (bei UCA1 auch nur diese 3 anzeigen?!) + Gelbild • CK20: LC-PCR mit versch. ZL • GVO 449+450 • Beschichtung für CK20 (SP6T7)  Agilentbild (Erklärung!!!) • Kontroll-PCR

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