第六章基因的表达与调控 ( 上 ) 原核基因表达调控模式

第六章基因的表达与调控 (上)原核基因表达调控模式自然选择倾向于保留高效率的生命过程。在每30分钟增殖一次的109细菌群体中，若一个细菌变成29.5分钟增殖，经过80 天的连续生长后，这个群体中的 99.9% 都将具有29.5 分钟增殖一倍的生长速度。

原核生物细胞的基因和蛋白质种类较 少，如大肠杆菌基因组约为4.20×106bp 共有4 288个开放读码框（表6-1）。据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分子。

表6-1 大肠杆菌、伤寒杆菌和尿殖道支原体基因组中的基因总量比较与功能分析

每个大肠杆菌细胞有约15 000个核糖 体，50种核糖体蛋白、糖酵解体系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中必需的，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质被称为永久型（constitutive）合成的蛋白质。

另一类则被称为适应型或调节型 （adaptive or regulated），因为这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。如大肠杆菌细胞中一般只有15个 β-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万个分子。

6. 1 原核基因表达调控总论 随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达（gene expression），对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或gene control）。

图6-1基因表达的第一步是由RNA聚合酶拷贝DNA双 链中的模板链，生成与该序列完全互补的RNA链。

基因表达调控主要表现在以下二方面： 转录水平上的调控（ transcriptional regulation）；转录后水平上的调控（ post-transcriptional regulation），包括（1）mRNA加工成熟水平调控（differential processing of RNA transcrpt）；（2）翻译水平调控（differential translation of mRNA）。

细菌的转录与翻译过程几乎发生在 同一时间间隔内，转录与翻译相耦联（coupled transcription and translation）。真核生物中，转录产物（primary transcript）只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质（图6-2）。

原核生物的基因调控主要是转 录调控，包括负转录调控和正转录调控。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），阻止结构基因转录。根据其作用特征又分为负控诱导和负控阻遏二大类。

在负控诱导系统中，阻遏蛋 白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用于操纵区。

在正转录调控系统中，调节基因的产 物是激活蛋白（activator）。根据其作用特性分为正控诱导系统和正控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态（图6- 3，表6-2）。

图6-3 细菌 中的转录调控体系。 a. 负控诱导系统； b. 正控诱导系统； c. 负控阻遏系统； d. 正控阻遏系统。

σ因子在结构上具有同源性，所 以统称σ70家族，含有4个保守区（图6-4），其中第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA 解开成单链的过程。

图6-4 大肠杆菌中的б因子（以б70为 例）主要包括四个结构域。

σ54因子识别并与DNA上的-24 和-12区相结合（图6-5）。 σ70启动子只有在核心酶结合到 DNA链上之后才能与启动子区相结合，而σ54则类似于真核生物的TATA 区结合蛋白（TBP），可以在无核心酶时独立结合到启动子上。

图6-5 σ70 （上）和σ54 （下）因子识别 并结合在所调控基因上游的不同区域。

6. 2 乳糖操纵子与负控诱导系统 大肠杆菌乳糖操纵子（ lactose operon ）包括 3 个结构基因： Z 、 Y 和 A ，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。

3个结构基因各决定一种酶：Z编码-半乳糖苷 酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。

β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性 酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他 β- 半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。 β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。

6. 2. 1 酶的诱导—lac体系受调控的证据 一般情况下，lac+基因型大肠杆菌细胞内β-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞只有1 ～2 个酶分子。但是，在乳糖培养基上酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，超过105个酶分子/细胞。

在无葡萄糖有乳糖的培养基中，lac+ 细菌中将同时合成β-半乳糖苷酶和透过酶。用32P 标记的mRNA 与模板DNA 进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖 1～2分钟后，编码β-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA 量就迅速增加，去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降。

实验室常用两种乳糖类似物—异丙基 巯基半乳糖苷（IPTG ）和巯甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用发色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物（ gratuitous inducer）。

用35S标记大肠杆菌细胞（培养基中 没有半乳糖），将这些带有放射性的细菌转移到不含35S的培养基中，加入诱导物后β-半乳糖苷酶便开始合成。分离纯化β-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S 标记，说明这种酶是加入诱导物后新合成的。

6. 2. 2 操纵子模型及其影响因子 Jacob 和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，而且可以用实验方法进行研究，他们通过大量实验及分析，建立了现在已经被人们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型。

图6-9 Lac操 纵子的调控模式。

A. Z、Y、A基因产物由同一条多顺反子mRNA分子 所编码。 B. 该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。 C. 操纵区是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。 D. 当阻遏物与操纵区相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。 E. 诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能与操纵区相结合，诱发lac mRNA的合成。

图6-10 培养基中有 无诱导物对Lac mRNA及β-半乳糖苷酶活性的影响

阻遏物lac I基因产物及功能 lac 操纵子阻遏物mRNA 是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1 分子IPTG 结合, 每个细胞中有5～10个阻遏物分子。

β-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是 把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac 操纵子（图6-11）。

某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄 糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应（catabolite repression）。

cAMP与代谢物激活蛋白 cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由 ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。

大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由Crp基 因编码，能与cAMP 形成复合物。CRP 和cAMP都是合成lac mRNA所必需的， cAMP-CRP 是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。

图6-13 gal， lac 和ara操纵子上游启动子区与 CRP-cAMP 结合位点的相对位置分析

半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、 山梨醇等在降解过程中均转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导操纵子控制的，被称为降解物敏感型操纵子 (catabolite sensitive operon），由cAMP-CRP 调控。

图6-14 大肠杆菌lac操纵子启动区CRP-cAMP 及-35区，-10区序列分析。

cAMP-CRP复合物与启动子区的结 合是lac mRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使 DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。

图 6-15 CRP- cAMP 与上游 DNA 位点结合后造成模板 DNA 沿对称序列中央发生 >90°的弯曲

6. 2. 3 lac操纵子的调控区域—P、O区 P区（即启动子区）一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp，而O区（即阻遏物结合区）位于-7～+28 位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。

图6-16 不同操纵 子启动区及O区相对位置的比较。

6. 2. 4 lac操纵子中的其他问题 1、lac基因产物数量上的比较在完全被诱导的细胞中，β-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1 ：0.5 ：0.2 ，这个比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。

①lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体 相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。因此，存在着从mRNA的5'末端到3'末端的蛋白质合成梯度。

②在lac mRNA分子内部，A基因比Z基 因更易受内切酶作用发生降解，因此，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多。

2、操纵子的融合与基因工程 pur操纵子在染色体上位于lac操纵子沿转录方向的下游，中间只隔了一个控制细胞对T6 噬菌体敏感性的tsx基因。pur操纵子被“嫁接” 到lac启动子上，形成融合基因。因为lac启动子是一个很强的启动子，通过它可以使较弱启动子的转录增强。

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