ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO

1. ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO

2. Proyecto Genoma Humano El proyecto Genoma Humano (HGP) se inició en 1990 y fue completado en 2003, fue coordinado por • U.S. Department of Energy • National Institutes of Health • Wellcome Trust (U.K.) en los primeros años • Otras contribuciones desde Japon, Francia, Alemania, China, y otros. http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

3. Beneficios del Proyecto Genoma Humano en Medicina • Mejor diagnóstico (dx temprano, específico) de enfermedades genética e infecciosas • Detección temprana de mayor susceptibilidad a enfermedades • Mejor diseño de drogas • Terapia génica y desarrollo de sistemas de control de drogas • Farmacogenómica

5. Análisis del Polimorfismo • RFLP - restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción). • AFLP - amplified fragment length polymorphism • RAPD - random amplification of polymorphic DNA • VNTR - variable number tandem repeat • SSR - simple sequence repeat

6. RFLP • RFLP - restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción). • Tecnologia mas antigua • Diferencia entre secuencias de DNA en la que un DNA presente una secuencia de restricción que el otro DNA no presenta. • Los sitios de restricción son polimorficos

7. RFLP Procedimiento: • Corte con enzimas de restriccion • Separacion por electroforesis • Transferencia de DNA a filtro (Southern) • Hibridación sobre filtro: La sonda utilizada debe reconocer la secuencia donde se encuentra el sitio de restricción

8. LA ANEMIA FALCIFORME ES CAUSADA POR UNA MUTACION PUNTUAL DNA CCT-GAG-GAG GEN NORMAL (Hb A) Proteína Pro - Glu - Glu DNA CCT GTG GAG GEN MUTANTE Proteína Pro - Val - Glu Anemia Falciforme (Hb S) Enzima de Restricción utilizada : Mst I

9. RFLP Analysis

11. RFLP Analysis

12. PCR – RFLP • PCR – se obtiene la secuencia target (OJO: aún cuando se obtenga un producto de tamaño definido, no necesariamente la secuencia de los productos es la misma) • Digestión con enzimas de restricción • Electroforesis en gel • Transferencia e hibridación con sondas específicas si es necesario

13. RAPD • Random amplification of Polymorphic DNA (amplificación al random de DNA polimórfico) • Primers de 10 bases • 1 primer por reacción

14. Template DNA RAPD • Los primers se unen a varios sitios en el DNA templado • Sólo cuando los primers se hayan unido en sitios cercanos y estén orientados en direcciones opuestas, ocurrirá la amplificación

15. RAPD Template DNA Primers apuntan hacia afuera, entonces no ocurrirá la amplificación

16. RAPD Template DNA Primers apuntan a la misma dirección, entonces la amplificación no ocurrirá.

17. RAPD Template DNA > 2,000 bases Primers están muy alejados, entonces la amplificación no ocurrirá.

18. RAPD Template DNA Los Primers están a una distancia apropiada, ocurrirá la amplificación 100 - 1,500 bases

19. VNTR • VNTR ( Variable Number of Tandem Repeats): Repeticiones en tandem de número variable. • Secuencias cortas (10 - 100 bp) repetidas dentro de los sitios de restricción (si el análisis se hace por RFLP), o los sitios donde se anclan los primers (si el análisis es por PCR).

21. Sitio de restricción Repeticiones en tandem (Tandem Repeats) Sitio de restricción VNTR Analysis

22. 4 repeticiones 9 repeticiones 17 pb

24. VNTR Analysis

25. SNPs SNPs : Single nucleotide polymorphism (polimorfismo dado por la diferencia en un solo nucleótido) Detección por PCR : primers diseñados con la misma secuencia pero con la ultima base (extremo 3’) cambiada según el polimorfismo que se quiera detectar. DNA Templado 3´ 5´ 5´ 3´ primer La DNA polimerasa no puede iniciar aquí la extensión de la nueva cadena

26. SECUENCIAMIENTO DE DNA : Metodo de Sanger (uso de dideoxynucleótidos: ddNTPs)

27. Se realizan 4 reacciones por separado, los productos de cada tubo se visualizan en gel. Figure 7-29a

28. Uso de dideoxynucleótidos en el secuenciamiento marcados con agentes fluorescentes

29. APLICACIONES • Análisis evolutivo de especies relacionadas • Determinación de relaciones de filiación • Determinación de marcadores asociados con virulencia o alguna caracteristica fenotípica (pero no significa causalidad) • Determinación de polimorfismos que causan una enfermedad (dependiendo de dónde ocurre el cambio)

31. Región en el DNA no transcrita +1 GEN pppAAGUCACGUAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAU... Región transcrita pero no traducida 5´ UTR (untranslated region) Inicio de Transcripción downstream upstream Met-Lys-Ala- - Inicio de Traducción

32. Región promotora 5´UTR

33. Secuencias repetitivas simples • 1. DNA satélite: 5-500 pb en tándem (extensiones en el • orden de las megabases, ~ 106 pb) • Centrómero • DNA minisatélite: 5-100 pb en tándem (~ 103-105 pb) • Conservado: telómeros • Hipervariable (longitud): cerca de telómeros • → identificación de individuos (“fingerprint”) • 3. DNA microsatélite: 1-5 pb en tándem (10-40 pb) • Distribuidos de manera uniforme • Longitud variable → relaciones filogenéticas

34. Uso de minisatélites hipervariables en la identificación de individuos 1. Digestión de DNA con enzimas de restricción 2. Separación de fragmentos por electroforesis 3. Transferencia de DNA a membrana 4. Hibridación con sonda con secuencia de minisatélite marcada radioactivamente

35. Análisis de polimorfismo de tamaño de cromosomas en Leishmania • Comparación por PFGE del tamaño de cromosomas en cepas y aislamientos de pacientes de diferentes regiones del Perú • Variación de tamaño por amplificación /eliminación de genes ribosomales repetidos en tándem:

36. Polimorfismo en cromosoma que contiene los genes ribosomales en Leishmanias del complejo Viannia.

39. EJERCICIO Usted desea determinar por PCR si un paciente es portador del gen de la anemia falciforme. Indique: a) dónde ubicaría los primers a usarb) cuál sería el procedimiento a seguirc) cómo espera usted que sean los resultados