کشت پروتوپلاست و امتزاج پروتوپلاست در کلمها

1. کشت پروتوپلاست و امتزاج پروتوپلاست در کلمها

2. مقدمه • به واسطه دورگیری بدنی امتزاج پروتوپلاست می تواند بر ناسازگاری جنسی در میان گونه ها یا جنس های گیاه غلبه کرد و انتقال ژن مقاومت به بیماری ها(ویروسی، باکتریایی و قارچی)، آفات، علفکش ها و دیگر فاکتور های تنشی، انتقال سیتوپلاسم نرعقیم یا افزایش حجم متابولیت های ثانویه در گیاهان را انجام داد. • پروتوپلاست های ایزوله شده یک سیستم بی نظیر برای مطالعه ساختمان و وظایف اندامکهای سلولی، غشاء سیتوپلاسمی در گیاهان و تشکیل دیواره سلولی بکار می رود.

3. تاریخچه • Klerceker اولین ایزوله کردن مکانیکی پروتوپلاست ها را در سال 1892 از بافت Stratiotes aloides L. انجام داد. به دلیل پایین بودن غلظت پروتوپلاست های ایزوله شده، ایزوله کردن پروتوپلاست ها بعنوان یک روش نامناسب تا زمان هضم شیمیایی دیواره سلولی بوسیله انزیمهای پکتیناز، همی سلولاز و سلولاز ایزوله شده از قارچ (Trichodorea viridem) بحساب می آمد. • در سال 1960، Cocking برای اولین بار تعداد زیادی پروتوپلاست در نوک ریشه گوجه فرنگی با بکار بردن آنزیم ها با فعالیت سلولاز و پکتیناز بدست آورد. • اولین گیاهان بازیافت شده از پروتوپلاست بوسیله Nagata ,Takebe(1971) در تنباکو بدست آمد. • برطرف کردن واقعی در سال 1978 زمانی که به خاطر امتزاج پروتوپلاستSolanum tuberosum و S. Lycopersicumاز خانوادهSolanaceseانجام شد، سلولها هیبرید تشکیل شده بودند و گیاهان از آنها که نمی توانند بوسیله دورگ گیری جنسی تولید شوند، بازیافت شدند. دو نوع دورگه تولید شده بود که یک نوع با کلروپلاست های سیب زمینی و نوع دیگر با کلروپلاست های گوجه فرنگی بودند و شاخه های مانند سیب زمینی تولید می کردند ولی گل نمی داند.

4. ایزوله کردن پروتوپلاست ها • ایزوله کردن آنزیمی پروتوپلاست ها در سلول های پارانشیمی با دیواره سلولی چوب پنبه ای نشده محدود می شوند، سلول های با دیواره سلولی چوب پنبه ای شده به آنزیم ها مقاومت نشان می دهند. بوسیله کاربرد لوازم آنزیمی با فعالیت سلولاز و پکتیناز در بافت ها و سلول ها این امکان وجود دارد که سلولز دیواره سلولی، سلول های گیاهی حذف شود تا پروتوپلاست های کروی بدست آید. • ایزوله کردن به دو صورت است: • 1- مکانیکی دو مرحله ای • 2- آنزیمی یک مرحله ای

5. عوامل موثر در ایزوله کردن پروتوپلاست ها • 1. منبع بافت • 2. گونه گیاهی و رقم • 3. شرایط فیزیولوژیکی گیاه بخشنده • 4. ترکیب مخلوط آنزیمی و دوره فعالیت آنزیمی • 5. ویژگیهای اسمزی استخراج مخلوط

6. مواد گیاهی • پروتوپلاست ها ممکن است از بافت ها متفاوت و اندامهایی شامل برگ ها، انتهای ساقه و ریشه، کلئوپتیل ها، هیپوکوتیل ها، دمبرگ ها، جنین ها، دانه های گرده و... استفاده می شود. • منبع معتبر پروتوپلاست ها برای جنس Brasicae سلول ها مزوفیل برگ می باشد. • شرایط فیزولوژیکی گیاه در موفقیت ایزوله کردن پروتوپلاست ها موثر است، بنابراین گیاهان باید در شرایط کنترل شده(نور ودما) رشد داده شوند.

7. آنزیم ها • غلظت و کارآیی پروتوپلاست های ایزوله شده به غلظت آنزیم های مصرف شده، دوره فعالیت آنزیمی، PH محلول آنزیمی، دما، نسبت محلول آنزیمی به حجم بافت گیاهی بستگی دارد. پکتیناز (تجزیه دیواره میانی و جداسازی سلول های اختصاصی) • آنزیم ها سلولاز و همی سلولاز( تجزیه دیواره سلولی و رها سازی پروتوپلاست)

8. آنزیم ها تصفیه شده و صاف هستند. با افزایش استحکام پروتوپلاست ها، نمک های غیر آلی (Ca2+) و بافر های آلی اضافه می شوند تا تغییرات PH در طی تلقیح به حداقل برسد. • تصفیه پروتوپلاست ها و حذف کامل ضایعات دیواره سلولی، پروتوپلاست های آسیب دیده به وسیله سانتریفوژ سریع انجام می شود.

9. شرایط اسمزی • پتانسیل اسمزی بوسیله افزودن مانیتول، سوربیتول، گلوکز و ساکارز در مخلوط آنزیمی، شستن محلول و بستر کشت تنظیم می شود. • پتانسیل اسمزی بهینه بینmOsm 700-470 است. میزان بالای پتانسیل اسمزی از ترکیدن پروتوپلاست ها جلو گیری می کند، اما ممکن است مانع تقسیم سلولی بشود.

10. تصفیه پروتوپلاست • شرط موفقیت در کشت پروتوپلاست حذف انزیم های ایزوله شده، قطعات هضم نشده بافتها و پروتوپلاست های کاملا آسیب دیده است. معمولا پروتوپلاست ها بوسیله ترکیب صافی، سانتریقوژ و شستن تصفیه می شود. حجم محلول آنزیمی پروتوپلاست ها با الک نایلونی(100-50μm) صاف می شود تا قسمت های بزرگتر هضم نشده بافت و دسته های سلولی حذف شود. حذف بیشتر سلولهای آسیب دیده و آنزیم های ایزوله بوسیله سانتریفوژسریع (xg75-100و 10-3min) انجام می گیرد و دوباره دربستر شستشو داده می شود.

11. کارآیی و غلظت پروتوپلاست ها ♪برای موفقیت در کشت پروتوپلاست ها، کارآیی بالا و غلظت کافی آنها مهم است. برای ثبات کارآیی پروتوپلاست چندین را استفاده می شود. • 1- • 2- آبی، پروتوپلاست های زنده رنگدانه ها در سراسر غشاها • 3- رنگدانه قرمز طبیعی که فقط بطور متابولیکی در سلولهای فعال غلیظ می شوند. • 4- مشاهده جریان سیتوپلاسمی به جهت شناسایی متابولیسم فعال

12. کشت پروتوپلاست ها • فاکتورهای مهم کشت، ترکیب بستر کشت، به ویژه حجم قندها، دما و شدت نور است. مایع • بستر کشت: جامد • کشت پروتوپلاست در بستر مایع: • کشت قطره ای • کشت در اتاقک های کوچک • کشت قطرات کوچک • پروتوپلاست سوسپانسیون ترکیب بستر مایع و جامد ممکن است استفاده شود، زمانی که سوسپانسیون پروتوپلاست در آگار یا آگارز بسته می شود و سپس بلوک ها بریده می شود و کشت چنین بلوک هایی در بستر مایع انجام می شود.

13. شرایط بیرونی کشت پروتوپلاست نور باززایی از پروتوپلاست باززایی به این معنی نیست که فقط یک دیواره سلولی جدید سنتز شود بلکه تولید یک گیاه مورد نظراست. اولین علامت قابل مشاهده رشد پروتوپلاست شامل تولید تعداد زیادی از اندامک های اطراف سلول و تشکیل دیواره سلولی جدید است. تشکیل دیواره سلولی بعد از ایزوله کردن پروتوپلاست شروع می شود.فرایند باززایی گیاهان از پروتوپلاست بوسیله Nagata , Takabe به سه مرحله متوالی تقسیم می شود: مرحله اول؛ مرحله آغازشمرحله دوم؛ مرحله تمایزمرحله سوم؛ مرحله ریشه دهی

14. امتزاج پروتوپلاست • اهداف آزمایشات با امتزاج پروتوپلاست در انتقال: • انتقال ژنهای مقاومت به پاتوژن ها • نرعقیمی ستوپلاسمی • مقاومت به تنش های شوری، خشکی و سرما • مقاومت به حشرات • ژنهای تولید کننده پروتئین های نگهدارنده، ویتامین ها، متابولیت های ثانویه داوریی دورگ گیری سوماتیکی گیاهان شامل 4 مرحله است: 1- ایزوله کردن پروتوپلاست ها 2- امتزاج پروتوپلاست 3- ایزوله کردن و باززایی گیاهان 4- آنالیز گیاهان باززایی شده.

15. القاء امتزاج پروتوپلاست • به دو طریق صورت می گیرد: 1- امتزاج شیمیایی 2- امتزاج الکتروفوزیون ♫امتزاج شیمیایی با پلی اتیلن گلیکول(PEG): در سال 1974 توسط Kao و Michayluk معرفی شد. ♪ الکتروفوزیون

16. مکانیزم امتزاج: • امتزاج پروتوپلاست شامل سه مرحله است: 1- 2- امتزاج غشاها در محل های مشابه قرار گرفته 3- تشکیل پل های بین پروتوپلاست، اطراف پروتوپلاست های امتزاج یافته

17. انتخاب هیبرید های سوماتیکی 1- انتخاب دستی: دقت زیاد اما زمان بر 2- جریان سیتومتری

18. Brassicaceaeخانواده • 380 جنس • 3200 گونه یکساله، دو ساله وچند ساله Brassicae oleracea L. گیاهان دو ساله با ریشه های باریک و بیشتر از 2 متر طول ساقه، گلها زرد گوگردی بندرت سفید، میوه خورجین با یک منقار کوچک در نوک می باشد. تغییر اطلاعات ژنتیکی بین B.O.var capitata(کلم) وRaphanus sativus(تربچه) در سال 1924 بوسیله Karpecenko توانست بوسیله آمیزش جنسی، یک جنس مصنوعی Raphanobrassicaرابوجود آورد.

19. امتزاج پرتوپلاست ها در جنسBrassica • بسیاری از امتزاج های بین گونه ای و بین جنسی در اوایل دهه 80 (1980) بین نماینده های خانواده Brassicaceae در گیاهان خوب باززایی شده انجام شده بود (Arabidopsis thaliana, B. campestris, B. napus, B. oleracea). • منبع پرتوپلاست ها برای آزمایشات با گونه های جنس Brassica کوتیلدن، برگ های جوان، هیپوکوتیل، ریزجوانه ها و سوسپانسیون های سلول می باشد. در بعضی از نماینده های جنس Brassica در جدول زیر آورده شده است.

21. دورگ گیری بین گونه ای و درون گونه ای جنس Brassica • Glimelius و Sunberg (1986) ژنوم B. Napusبه واسطه دورگ گیری سوماتیکی بعنوان محصول دور گیری بین گونه ای گونه والدی B. oleracea و B. campestris تولید کردند. • به طور مشابه Ren و همکاران(1999) ژنوم B.napus با امتزاج پروتوپلاستB. rapa دو باره تولید کردند کهمقاومت آن به Erwinia carotovora افزایش یافت. شکل زیر امکان دورگ گیری بین گونه ای را نشان می دهد.

23. بررسی دورگ گیری بین گونه ای و درون گونه ای در جدول زیر داده شده است

24. دورگ گیری بین جنسی با جنس Brassica دورگ گیری سوماتیکی بین جنسی از میان محصولات مهم جنس Brassicaبا جنس های وحشیمتفاوت:Arabidopsis, Barbarea, Camelina, :Capsella, Diplotaxis, Eruca, Moricandia, Raphanus, Sinapsis, Thlaspi که بیشتر در جدول 3 آمده است. پرتوپلاست A. Talianaاشعه دیده با دزهای UV با پرتوپلاست B.napusاستفاده کردند ودیدند که بیش از 312 گیاه باززایی شد که در 52 گیاه حضور DNA از A. taliana تایئد شده بود.

26. گیاهان هیبریدی بین کلم قرمز و تربچه بوسیله Kamaya و همکاران بدست آمد که انتخاب هیبرید ها با استفاده از القاء یداستامید که از تقسیم سلولی پرتوپلاست های کلم جلوگیری می کند انجام شد. از 10 گیاه فقط 2 گیاه گل دادند و آنها مشابه کلم بودند. دمبرگ ها باریک تر از کلم، گل ها کوچک تر و زرد بودند. بر طبق مرفولوژیکی، تعداد کروموزم ها، ایزوآنزیم الگو و قطعات DNA کلروپلاست گیاهان بین جنسی، هسته های کلم و کلروپلاست تربچه بود. • Shepherd s pures کیسه کشیش (Capsella bursa-pastoris) به طور وحشی رشد می کند و مقاوم به سرما و Alternaria brassica و A.brassicola است. Singareva , Earle از پروتوپلاست مزوفیل کیسه کشیش و پروتوپلاست مزوفیل کلم تیمار شده با یداستامیداستفاده کردند. فقط 8/1% گیاهان باززایی شده از کالوس مشابه کیسه کشیش بود. در چندین گیاه، حجم DNA، مجموع حجم DNA والدین بود.

27. جنس Moricandiaاز خانواده Brassicaceae است. فتوسنتز آن نوع انتقالی بین گیاهان C3وC4 است، این یک حالت متفاوت آنزیم گلیسین دکربوکسیلاز در سلول های برگی و ترکیب آناتومی برگ با کلاس بندی اندامک ها متفاوت(میتوکندری و کلروپلاست) در سلول های دستجات آوندی دارد. • Yan و همکاران یک امتزاج پروتوپلاست بین B.oleracea و M.nitens (گونه وحشی نوع فتوسنتزC3-C4) انجام دادند. 425 گیاه بدست آمد که 90% آنها بر اساس مشاهدات مرفولوژیکی تعداد کروموزم ها و آنالیز RAPD هیبرید بودند. به طور مرفولوژیکی، گیاهان هیبریدی بین والدین امتزاجی (شکل برگ، رنگ گلبرگ) بودند. در بعضی از گیاهان، پرچم هایی با تعداد کمی دانه های گرده بارور وجود داشت. به طور سیتولوژیکی گیاهان هیبریدی 46(18+28)،74 و 92 کروموزم داشتند. برطبق اندازه گیری نقطه جبرانCo2، در چندین گیاه هیبریدی تبادل گاز به صورت انتقال مابین M.nitens(C3-C4) و B.oleracea(C3) والدین ظاهر شده بود.

28. www.Hortilover.net