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BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES

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BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES. EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOS São Paulo 2005. Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências. 1. Introdução.

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bruno leonardo de freitas soares
BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES

EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOS

São Paulo

2005

Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências

1 introdu o
1. Introdução

1.1 - Contexto

  • Bywaters, 1941

Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticas

  • Haimovici, 1960

Síndrome metabólica pós-revascularização

  • Haimovici, 1973

Síndrome mionefropática ou de reperfusão

  • Burihan, 1982

O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndrome

Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1:427-32.

Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47.

Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44.

Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.

1 1 contexto
1.1- Contexto
  • Myers, 1986

 Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemia

  • Joves, 1982

 A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda

  • Ward, 1988

 Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimento

Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97.

Joves DB. Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254.

Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7.

1 1 contexto1
1.1- Contexto
  • Granger, 1988

 Radicais livres de oxigênio e lesão celular

  • Vargas, 1995

 Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratos

  • Kelly, 1996

 Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1)

Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75.

Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.

Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63.

1 1 contexto2
1.1- Contexto
  • Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1)
  • Vargas, 1995

 Bloqueio de substâncias quimioatrativas

  • Linderman, 1998

 Diminuição da adesividade leucocitária

  • Gupta, 1998

 Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1

  • Linderman, 1998

 Diminuição da resistência vascular periférica

Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal

reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.

Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15.

Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.

1 2 hip tese
1.2- Hipótese

O uso do alprostadil, por via intravenosa, atenua o efeito das lesões metabólicas e histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

1 3 objetivo
1.3- Objetivo

Avaliar os efeitos da infusão intravenosa do alprostadil num modelo experimental de isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

2 m todos
2. Métodos

Projeto aprovado pelo comitê de ética da UNCISAL, protocolo 16-A, em13/10/2004.

2.1-Tipo de estudo

- Ensaio clínico aleatório em animais de experimentação

2.2-Local

2.2.1-Laboratório do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória - FMSP-BA

2 m todos1
2. Métodos

2.3 –Amostra

    • Ratos machos
    • Linhagem OUT B Wistar
    • Idade - 90 a 120 dias
    • Peso - 250 a 350 g
    • 15 dias - observação e adaptação
    • Condições controladas

2.3.1 – Amostragem

  • Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BA
2 m todos2
2. Métodos

2.4 Procedimentos

2.4.1 - Randomização

- Envelopes

- Sorteio aleatório

- Examinadores

slide11

2. Métodos

2.4 Procedimentos

2.4.2 - Grupos experimentais

  • Grupo Sh (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento.
  • Grupo Ct ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão.
  • Grupo Al ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão.
2 4 procedimentos
2.4 Procedimentos

2.4.3 Modelo experimental

  • Pré operatório
    • Foram submetidos a jejum (6h)
    • Foram devidamente pesados
    • Submetidos a sorteio
  • Anestesia
    • Fenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitoneal
    • Sono profundo
    • Estímulos dolorosos irresponsivos
    • Doses complementares de anestésico
2 4 procedimentos1
2.4- Procedimentos

2.4.3- Modelo Experimental

  • Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa
  • Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear
  • Incisão abdominal mediana
  • Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do segmento abdominal até acima das artérias renais
  • Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al)
  • Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al)
  • No Grupo Sh não há isquemia e reperfusão
2 4 procedimentos2
2.4- Procedimentos

2.4.3- Modelo Experimental

  • Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Alprostadil (Grupo Al), antes da reperfusão
  • Amostras de sangue
  • Nefrectomia esquerda e preparo das peças
  • Eutanásia – dose anestésica letal
2 4 procedimentos4
2.4 Procedimentos

2.4.3 Modelo experimental

  • Estudo histológico (microscopia ótica)
    • Hematoxilina eosina
    • Ácido Periódico de Schiff (PAS)
    • Azul patente (Azul de Alcion)
  • Estudo Imunohistoquímico (Laboratório de biologia molecular da Fiocruz-Salvador)
    • Amostras de Tecido Renal
2 5 1 vari veis prim rias
2.5.1- Variáveis primárias

2.5.1.1- Estudo imunohistoquímico

  • Dosagem de Molécula de adesão intercelular do tipo 1 (ICAM-1)
  • Análise qualitativa de desarranjo estrutural
2 5 1 vari veis prim rias1
2.5.1- Variáveis primárias

Tecido renal sem isquemia

Tecido renal com isquemia e reperfusão

2 4 procedimentos5
2.4 Procedimentos

Grau II

Grau I

2 4 procedimentos6
2.4 Procedimentos

Grau IV

Grau III

2 5 1 vari veis prim rias2
2.5.1- Variáveis primárias

2.5.1.2- Estudo histológico Jablonski, 1983

  • Grau 0: Normal
  • Grau 1: Mitoses e necrose de células individualmente
  • Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos contorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveis
  • Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo contorcido proximal. Desarranjo estrutural moderado
  • Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo contorcido proximal com desarranjo estrutural severo intersticial
2 5 1 vari veis prim rias5
2.5.1 Variáveis primárias
  • 2.5.1.2 Estudo histológico

Grau IV

Grau III

slide25
2.5.2 Variáveis secundárias

2.5.2.1- Avaliação bioquímica sérica

  • Desidrogenase lática Leucometria
  • Creatina-fosfoquinasePotássio
  • Lactato Hemogasimetria
  • Uréia
  • Sódio
  • Creatinina
  • Cálcio
slide26

2.6- Modelo Estatístico

2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra

2.6.2- Análise estatística

  • Análise de variância por postos de Kruskal Wallis
  • Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentes
  • P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidade
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3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias

Gráfico 1. Distribuição dos graus de necrose entre os grupos

3 resultados 3 3 vari veis prim rias1
3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias

Gráfico 2. Análise Imunohistoquímica entre os grupos

3 resultados 3 3 vari veis prim rias2
3. Resultados3.3 Variáveis Primárias

Gráfico 3. Comparativo da análise histológica entre os grupos

3 resultados 3 1 caracteriza o da amostra
3. Resultados 3.1 Caracterização da amostra

□ Grupo Sh □ Grupo Ct □ Grupo Al

Gráfico 4. Médias do pesos dos ratos dos três grupos de tratamento.

3 resultados 3 3 vari veis secund rias
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

Gráfico 5. Comparação dos níveis de eletrólitos dos três grupos de tratamento.

3 resultados 3 3 vari veis secund rias1
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

■ Grupo Al

Gráfico 6. Comparação de LDH e CPK dos três grupos de tratamento.

3 resultados 3 3 vari veis secund rias2
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

Controle

Alprostadil

SF0,9%

Gráfico 7. Comparação da Gasometria (pO2 e pCO2) dos três grupos de tratamento.

3 resultados 3 3 vari veis secund rias3
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

■ Alprostadil

Gráfico 8. Comparação de Lactato e Uréia dos três grupos de tratamento.

4 conclus es
4. Conclusões
  • O Alprostadil, na dose de 20 microgramas/kg, atenua as repercussões imunohistoquímicas e histológicas em tecido renal de ratos submetidos a um modelo experimental de isquemia e reperfusão com clampeamento aórtico supra-renal
  • Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na dose de 20 microgramas/kg, não foi capaz de modificar as alterações metabólicas pelos parâmetros utilizados neste estudo