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重组 DNA 技术. 生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：. （ 1 ）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化； （ 2 ）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。. 生物技术将是未来经济发展的新动力 第一次技术革命 工业革命 解放人的双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身.
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生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因： （1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。 • 生物技术将是未来经济发展的新动力 第一次技术革命 工业革命 解放人的双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身
基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。 基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物,生物化学和细胞生物学实验实施的基础。
1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。
科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。 1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。
重组DNA操作一般步骤： （1）获得目的基因； （2）克隆:目的基因与载体连接，形成重组的DNA分子； （3）转化：用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）筛选：对转化子筛选和鉴定； （5）大量培养：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） “纵向”体系
总体技术路线 分 目的基因 基因载体 切 接 表 转 重组体 筛
(分)------目的基因及载体的分离 获得需要的目的基因常用的方法： （1）化学合成 （2）基因组文库(genomic DNA library) （3）cDNA文库 （4）聚合酶链式反应（PCR）
化学合成 • 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段（60-80bp） 多肽链的氨基酸顺序 mRNA的碱基排列顺序 相应的基因结构 化学合成目的基因
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。 化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（３）价格昂贵。 用途： PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针
基因组文库 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建 基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。
基因组文库 基因组文库是含有某种生物全部基因片断的DNA克隆群体。直接从生物体中提取总DNA，用超声或酶处理，将染色体DNA切割成片断，插入载体，转入受体菌扩增，得到基因组DNA文库，从中调用目的基因；缺点结构基因只含基因组很小一部分，有重复序列，假基因。真核生物基因组有内含子。这些给从基因组克隆目的基因带来困难。
cDNA文库 cDNA文库的构建 用细胞总mRNA，制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c－DNA文库。 mRNA 反转录酶 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 第二条DNA链 以mRNA为模板，用反转录酶，合成与mRNA互补的cDNA(complementary DNA, cDNA) 片段，插入载体，转入受体菌扩增，得到cDNA文库；
比较基因组文库与cDNA文库 • 构建基因组文库获取目的基因存在的问题—— 费时费事 内含子序列 • 反转录人工合成互补DNA方法的优势—— 不含内含子序列 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR） • 将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术 • PCR(Polymerasechainreaction)--聚合酶链式反应 • 分子生物学，医学，考古，法医 • 美国Mullis教授1988年发明了PCR技术 • 1993年获得诺贝尔奖
载体DNA的选择 理想载体的基本条件： 可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。 合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。 多克隆位点：广泛、特异 选择标志，便于筛选和鉴定 分子较小，可容纳较大的外源DNA
种类： 质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 ……
质粒载体的一般结构 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。
DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） “纵向”体系
切------限制性内切酶酶切 限制性内切酶酶切 酶切
载体和目的基因的切断 • 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 • 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 • 由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。
DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） “纵向”体系
接------载体和目的基因的连接 • 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 • （一）粘性末端连接法： • 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 • 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。
（二）人工接尾法： • 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 • 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。
（三）人工接头连接法： • 将人工连接器（linker,即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段,约10~20个核苷酸， ）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 • 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。
DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） “纵向”体系
转------重组体的转化 重组体的转化 受体细胞
宿主菌或受体细胞 ①原核系统 大肠杆菌 枯草杆菌 ②真核系统 酵母菌酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
原核细胞的转化（细菌转化） 受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染
感受态细胞（competent cell） • 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 • 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 • 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competent cells)。
转化 CaCl2处理 大肠杆菌细胞 大肠杆菌感受态细胞 与重组DNA共同冰浴 而后42℃短暂热刺激 得到噬菌斑或单菌落 50-100mmol/L CaCl2 受体细菌 感受态细菌 重组体转入细菌
转化方法 • E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高2~3个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。
真核细胞的转染 受体细胞系统 永生细胞系 细胞特异性的选择标记 对抗某种药物
转染方法 • 电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。
磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。 重组体+磷酸钙微粒 磷酸钙介导的转染 大颗粒 内吞作用 重组体进入细胞
基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。 • 激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。 • 显微注射法：利用毛细管直接将DNA注入细胞内。
脂质体（liposome）介导法：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。脂质体（liposome）介导法：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。 • 多聚物介导法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。
DNA重组的基本模式 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） “纵向”体系
重组体克隆的筛选与鉴定 转化后的克隆群体：
阳性重组子的筛选与鉴定 • 1、遗传检测法(根据重组载体的标志作筛选) ------插入失活法 ------α-互补法 • 2. 限制性酶切法 • 3. PCR法 • 4.杂交筛选法 • 5.免疫学方 法 • 6. 核苷酸序列测定法
遗传检测法 • 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。
对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。
