第六章菌种的选育、保藏与扩大培养

第六章菌种的选育、保藏与扩大培养

教学目标 • 1.了解发酵工业对菌种的要求 • 2.掌握菌种选育的方法及菌种保藏的原理和方法

菌种的筛选、选育和保藏 概述： 1、菌种的作用是决定发酵产品是否具有产业化和商业化价值的关键因素。是发酵工业的灵魂。 2、工业用微生物的分类可培养微生物：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌（霉菌）。未培育微生物：如极端微生物。利用方式有：模拟自然培养法、宏基因组分析法。

菌种的筛选、选育和保藏 • 模拟自然培养法模拟微生物生长的自然环境对未培养微生物进行可培养研究。 • 宏基因组分析法直接依据基因、基因组、蛋白质序列，以及调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用。即不通过纯培养过程，而是直接在基因水平上开发。

第一节发酵工业对菌种的要求 一、工业化菌种的要求 1、能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物。 2、有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强。 3、遗传性能要相对稳定。 4、不易感染它种微生物或噬菌体。 5、产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）。 6、生产特性要符合工艺要求。

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 • 二、菌种获得的途径 1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵水平高的批号中重新进行分离筛选 • 三、分离筛选的步骤定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养--菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 • 定方案 • 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 • 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 • 样品采集 1、采样对象来源广，获得的可能性大。以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。极端环境

从自然界筛选

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 • 样品预处理目的：提高菌种的分离效率物理方法化学方法诱饵法

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 • 富集培养目的：增加目标微生物数量方法： 1、底物 2、pH条件 3、培养时间 4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 • 菌种分离目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分离。常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 • 菌种的初筛分离得到的菌种，需要进一步筛选选择产物合成能力较高的菌株。生产性能的测定即通过初筛和复筛来确定。初筛：从分离得到的大量微生物中将具有目的产物合成能力的微生物筛选出来的过程。

菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选方法：1、平板筛选例：水解酶菌株在培养基中加入该酶的底物作为唯一的碳源或氮源，适温培养后根据水解圈和菌落的大小来判断产酶活力的大小。 2、摇瓶发酵筛选接近发酵条件，易于扩大培养。特点：简单快速，活性只能相对比较，不能得到确切的产量。

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 • 菌种的复筛一般用摇瓶发酵培养，发酵液用精确的分析方法测定。野生型菌株：直接从自然界样品中分离得到的具有一定生产性能的菌株。 • 复筛过程可以结合各种培养条件进行筛选，以便初步掌握适合野生型菌株的培养条件，为育种服务。

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选 • 菌种的鉴定程序为：测定一系列必要的鉴定指标------- 查找权威性的鉴定手册，确定菌种类型。不同的微生物有不同的重点鉴定指标。例如：真菌以形态指标为主要指标；放线菌、酵母菌以形态指标与生理指标兼用；细菌适宜生理、生化和遗传等指标。鉴定微生物的技术可分成4个不同的水平： 1、细胞的形态和习性水平 2、细胞组分水平 3、蛋白质水平 4、基因或核酸水平

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选经典的分类鉴定方法： 1、形态学特征 2、生理、生化特征 3、血清学试验 4、氨基酸顺序和蛋白质分析现代分类鉴定方法： 1、微生物遗传型的鉴定 2、细胞化学成分特征分类法 3、数值分类法直接到权威机构鉴定

菌种的筛选、选育和保藏 发酵工业菌种的分离、筛选四、已工业化产品生产菌的介绍 1、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源

菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选 2、氨基酸生产有关的微生物代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单氨基酸生产菌的要求：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌谷氨酸发酵的菌种：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌其它氨基酸生产菌：

菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选 3、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌

菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选菌种的筛选、选育和保藏发酵工业菌种的分离、筛选五、实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌采样（造纸厂） →80度30分钟处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 第二节、菌种的选育目的 • 防止菌种退化 • 解决生产实际问题 • 提高生产能力 • 提高产品质量 • 开发新产品

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 一、自然选育自然选育：不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 自然选育在工业生产上的意义问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变自然选育虽然突变率很低、进展慢，但却是工厂纯化菌种、防止退化、保证稳产高产的重要措施。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 二、诱变育种以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。包括染色体畸变和基因突变。诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。诱变因素：物理化学生物

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 化学诱变剂化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 （二）、诱变育种步骤 • 出发菌株的选择 • 处理菌悬液的制备 • 诱变处理 • 中间培养 • 分离和筛选

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 出发菌株的选择 1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞;有的作用于休止期，就可选用孢子。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。 • 诱变处理根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 分离和筛选 • 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 • 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 例：紫外线的诱变育种 • 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为260nm左右。灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 • 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 • 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 操作步骤 1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。 3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 例:亚硝基胍诱变曲霉菌 N—甲基—N‘-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。操作步骤 1．单孢子悬液制备取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 2．MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。 3．诱变处理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃ 3天后计数。 4．死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。 5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 诱变育种工作中应注意的几个问题 1、选择好出发菌株标准：产量高、对诱变剂敏感、变异幅度大。 2、复合诱变因素的使用单一诱变效果不高，复合诱变因素可扩大诱变幅度，提高效果。 3、剂量选择合适剂量及其确定的依据。 4、变异菌株的筛选发现与产量有关的特性（菌落形态、变异类型） 5、高产菌株的获得需要筛选条件的配合用辨证的观点来看问题

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 三、杂交育种发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长期使用诱变剂处理之后，其生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，有必要利用杂交育种方法。杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 杂交育种的目的： • 1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）； • 2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷； • 3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种； 4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。

甲生长快、产量低 乙生长慢、产量高生长快、产量高菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育基因重组

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 应用面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 CO2 多，生长快；酒精酵母:产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。

各种微生物进行杂交的方式 菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育原核：转化转导接合原生质体融合真核：有性杂交　　　准性杂交

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 几个概念 1.直接亲本：微生物杂交育种所使用的配对菌株。 2.遗传标记：颜色、营养要求和抗药性等。为什么进行遗传标记？ 3.营养缺陷型菌株：是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。 4.培养基分类

能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；一般除碳源外，多按比例混入一定的无机物，但有时也加入特定的有机物。例如链孢霉属就必须添加生物素。 • 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)； • 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。

菌种的筛选、选育和保藏菌种的选育 • 细菌的杂交 • 细胞的接触是导致基因重组的必要条件。 • 细菌的杂交还可以通过F因子转移，转化和转导等发生基因重组，但通过这些方式进行杂交育种获得成功的报导还不多。

在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在 F 因子所决定。 • F 因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为 5×107道尔顿； • 雌性细菌不含F 因子，称为F -菌株， • 雄性细菌含有游离存在的F 因子，称为F +菌株， • 当雄性细菌细胞中所含的F 因子被整合在细胞核的DNA 上，不呈游离状态存在称为Hfr 菌株（高频重组菌株）； • 有时被整合在细胞核DNA 上的F 因子，从DNA上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，F 因子有时能带一小段细胞核 DNA。我们将这种含有游离存在的但又带有一小段细胞核DNA 的F 因子的细菌称为 F′菌株。

接合的结果： F+ + F- 2 F+ F′ + F- 2 F ′ Hfr + F- 多种情况 Hfr + F- Hfr＋F-（多数情况下） Hfr + F- Hfr＋Hfr（少数情况下）

第六章 菌种的选育、保藏与扩大培养