“ 夹层杯 ” 液基抗酸杆菌检测法 湘雅医院检验科 刘文恩 Email:liuwenen@gmail

1. 湖南省卫生厅推广计划 “夹层杯”液基抗酸杆菌检测法 湘雅医院检验科 刘文恩 Email:liuwenen@gmail.com

2. 内 容 提 要 结核病发病情况 1 结核病的实验室诊断方法 2 夹层杯诊断技术 3 应用夹层杯检验技术的意义 4 湘雅医院应用情况介绍 5

3. 结核感染情况 • 全世界1／3的人口感染或曾经感染过结核 • 全球每年新发病例800－1000万,死亡超过300万。 • 我国属结核病高发病率国家之一,患者数仅次于印度，居世界第二位。 • 结核病仍然是世界卫生组织(WHO)和我国重点防治的重大传染性疾病。

4. 中国结核病感染特点 病例发 现率低 高感染率 及患病率 中国结核感染的特点 低递降率 高耐药率 高死亡率

5. 结核病的实验室诊断方法 细菌学检查是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和治疗、评价治疗效果的可靠标准。

6. 最基本的检查方法 涂片法 培养法 分子生物学方法 免疫学方法 实验室诊断 噬菌体法 酶联免疫斑点法 液体培养系统（自动化）

7. 噬菌体方法 分枝杆菌的噬菌体在研究中应用已有多年的 历史。近年来利用分枝杆菌噬菌体能特异性 地感染分枝杆菌的特性,开发成结核菌临床检测 试剂盒,检测临床标本中是否含有结核菌活菌,且 该技术快速、简便,将是否含有结核菌活菌的检 出时间缩短为48h。这是一项很有希望用于流行 病学研究和实验室检测的细菌学新技术。

8. 酶联免疫斑点法 酶联免疫斑点法或称结核感染T细胞斑点试 验。是检测抗原刺激后产生细胞因子—主要指γ- IFN 的外周血单个核细胞数, 根据斑点的数量来确 定细胞分泌细胞因子的情况, 从单细胞水平评价细 胞免疫功能, 从而判断结核分枝杆菌感染的情况。

11. 液体培养系统 是将一种O2敏感的荧光钌复合物加入分枝杆 菌生长指示管(MGIT)液体培养基中作为生长指试 剂,试管底部的荧光复合物与氧气结合时处于淬 灭状态, 结核菌生长时, 氧气逐渐减少, 荧光复 合物就发出荧光而被检测到。自动化的MGIT 还 可加入临界浓度的抗结核药物进行药敏分析。该 方法操作简便，阳性标本检出时间平均为9天。 但价格昂贵。

12. 涂片法的优缺点 • 包括：直接涂片法、厚涂法、离心浓缩集菌法、漂浮集菌法等 • 优点：简便易行,成本低廉,准确性较高 • 缺点：阳性率低，效果不理想。

13. 夹层杯液基抗酸杆菌集菌制片检测技术 沉降式夹层杯法 滤过式夹层杯法 夹层杯检测技术

14. 沉降式夹层杯法 检测原理 运用夹层杯技术，通过标本消化液 消化后，选择有效成分离心附着于透明 高分子薄片上，经过自动或手工染色， 将完成染色的薄片用取片针取出，人工 或计算机辅助阅片。

15. 检测流程示意图

16. 主要设备及相关材料

18. 滤过式夹层杯法 检测原理 经过消化后的标本通过滤过式夹层杯 过滤，将抗酸杆菌阻拦在纳米硅介质微孔 滤膜膜片上，直接染色。取出膜片置于 滴有光媒介液体的阅片夹中可以直接通 过普通显微镜进行观察。

19. 检测流程示意图

20. 主要设备及相关材料

21. 夹层杯诊断技术的优点 阳性率高 背景清晰，易于观察 夹层杯诊断 技术的优点 易于标准化 检测速度快 生物安全性好

22. 阳性率高 液基抗酸杆菌集菌制片技术在标本中 加入消化液,有助于降解标本中的蛋白成 分,使标本中的结核菌分散出来，且所用 的标本量明显大于直接涂片法，故大大提 高了阳性率。

23. 背景清晰，易于观察 由于蛋白分解, 避免蛋白成分的聚集, 从而抗酸 杆菌分布均匀,而且染色后背景清晰,很容易观察到 抗酸杆菌的存在。

24. 易于标准化 夹层杯诊断技术整个实验过程均可执行标 准化:标本体积定量;标本收集保存条件可控制; 染色温度、时间可控制;夹层片的面积是固定 的, 通过离心后细菌均匀沉积在夹层片上, 油 镜每个视野的实际面积也是可以计算的。通过 计算机处理后, 可准确计算每毫升痰液中抗酸 杆菌量。

25. 检测速度快 液基结核菌集菌制片技术,单台TQ-12 离心涂片机,单人每日可完成100例标 本制片,阅片。而滤过式夹层杯的检测 速度更快捷，十分钟就可检测5份标本。

26. 生物安全性好 整个操作均在容器中进行，并且进行 了灭活处理，安全性很高。标本经树胶封 存于载玻片上,显微镜无须与含菌面接触, 检验人员降低了实验室感染风险。

27. 应用夹层杯检验技术的意义 1 解决结核杆菌痰检长期存在的技术问题 1 更好的社会效益 2 新的科研手段 3 4 细胞学检验方法 检验科新的效益增长点 5

28. 解决抗酸杆菌痰检长期存在的技术问题 阳性率偏低 安全性 存在的 问题 其它类型标本 其它微生物 检验项目 工作效率 标准化

29. 阳性率偏低问题 痰标本抗酸杆菌检出率低，这是长期困扰 检验科的难题，在各级医院都存在临床明确诊 断而实验室查不到抗酸杆菌的情况，一些不理 解情况的医师甚至会怀疑检验科的技术水平， 提高应用这项技术这个问题肯定会得到明显改 善。

30. 安全性问题 实验室生物安全是检验科工作的重要 环节，夹层杯法液基结核杆菌检验从技术 角度解决了这个难题。首先采用完全密闭 的容器进行离心，避免了气溶胶的形成， 再有通过强灭活消化液配合加温彻底杀灭 结核杆菌。

31. 标准化问题 传统的痰检方法要做到标准化从技术 角度很难实现，主要依靠经验进行工作， 夹层杯痰检技术的整个操作和流程可以通 过时间、温度、标本量等技术参数进行量 化，因此这项技术很有希望成为结核杆菌 痰检的标准方法。

32. 提高了工作效率 从操作上看，夹层杯法在时间和程 序上看好像复杂了很多，其实从整个抗 酸杆菌检验角度看提高了工作效率。 首先标本可以批量操作，再有由于通过 强消化液和离心的处理后，细菌的高度 集中可以大大节省阅片时间，一些老方 法要用几分钟才能看到细菌的标本用本 法可能很短的时间就看到了。

33. 其它标本结核杆菌检验问题 在临床上经常会遇到各种体液标本 查找抗酸杆菌的情况，检验科工作人员 经常感到头痛，因为费了很多周折往往 找不到细菌，用夹层杯法集菌查找即快 捷又可以明显提高阳性率。

34. 其它微生物检验项目的开展 • 脑脊液新型隐球菌检查； • 分泌物中淋病双球菌检查； • 各种皮肤真菌检验； • 组织悬液的细菌学检查。

35. 更好的社会效益 • 早日发现并确诊结核病患者是结核病防治的最有效方式，研究数据表明，目前有70％的结核病患者并不能够在初次检查时查到结核杆菌，不良的生活习惯如随地吐痰加重了结核病的流行。 • 尽早发现结核病感染者是检验科的责任，因此从痰检中更早发现抗酸杆菌对结核病防治意义重大。

36. 新的科研手段 流 行 病 学 调 查 动 物 模 型 检 查 手 段 新 的 细 菌 培 养 模 式 新 的 药 敏 实 验 方 法 自 动 化 痰 检 技 术

37. 细胞学检验方法 • 妇科宫颈癌细胞学检查； • 痰液细胞学检查； • 胸腹水脑脊液细胞学检查； • 尿液细胞学检查等。

38. 检验科新的效益增长点 全套设备投资较少，湖南省的收 费标准三级医院是50元/次，一般情况 只要完成1200例检查就可以收回仪器 投资。

39. 应 用 情 况 湘雅医院临床应用情况 临 床 研 究

40. 临床研究 留取152例临床标本(100例痰标本、23 例支气管分泌物标本、7例脑脊液标本、22 例穿刺液标本)均来自本院住院、门诊及急 诊患者,标本选取方式为根据医嘱留取,每 例标本同时采用液基抗酸杆菌集菌制片技 术和直接涂片染色法平行处理,并将其结果 进行比较分析。

41. 判断结果方法 • 至少观察100个视野,未发现抗酸杆菌者应继续观察300个视野 • 每300个视野0条为(-) • 每300个视野1-8条时应直接报告所查到的抗酸杆菌条数 • 每100个视野3-9条为(+) • 每10个视野1-9条为(++) • 每个视野1-9条为(+++) • 每个视野≥10条为(++++)

42. 结 果 表1 液基抗酸杆菌集菌制片技术与直接涂片染色法检测结果比较

43. 表2 液基抗酸杆菌集菌制片技术与直接涂片染色法检出菌量的比较

44. 镜下比较 痰涂片镜检法 夹层杯集菌法

45. 应用情况 湘雅医院微生物实验室自2010年7月1 日搬迁新院至今：共检测临床标本7050 例，阳性标本共225例，阳性率为3.19%。 包括4例脓汁、3例穿刺液、2例胃液、1例 脑脊液、1例大便、1例胸水标本，其余为 呼吸道标本。

46. 夹层杯诊断技术所获荣誉 • 15项国家专利 • 3项国际专利 • 荣登“十一五国家重大科技成就展 • 技术应用后合作单位及应用单位发表论文18篇

47. Thank you for your attention!