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南京农业大学 生命科学学院. 分 子 生 物 学. 第五章 分子生物学研究法(上). 南京农业大学 生命科学学院. 2. ——DNA 、 RNA 及蛋白质操作技术. 2014/4/1. 第五章 分子生物学研究法(上). 南京农业大学 生命科学学院. 3. 2014/4/1. 从 20 世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速发展,主要原因之一是研究方法,特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括 DNA 分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和 PCR 扩增等,是分子生物学研究的核心技术。.

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第五章 分子生物学研究法(上)

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——DNA、RNA及蛋白质操作技术

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第五章 分子生物学研究法(上)

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从20世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速发展,主要原因之一是研究方法,特别是基因操作和基因工程技术的进步。

基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。

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第五章 分子生物学研究法(上)

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基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。

基因工程技术是核酸操作技术的一部分,只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。

事实上,这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。

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第五章 分子生物学研究法(上)

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  • 内容:
      • 重组DNA技术回顾
      • DNA基本操作技术
      • RNA基本操作技术
      • 基因克隆技术
      • 蛋白质组与蛋白质组学技术

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第一节 重组DNA技术回顾

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  • 三大成就
    • 40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;
    • 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;
    • 50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。
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第一节 重组DNA技术回顾

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重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。

限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的,它能特异性识别GAATTC序列,将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。

早在1967年,世界上有5家实验室几乎同时报道了DNA连接酶。

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几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端

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DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a. DNA的粘性末端;b. DNA的平末端; c. 化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。

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第一节 重组DNA技术回顾
  • 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组,还不能满足基因工程的要求,只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上,才能在寄主细胞中进行繁殖。
  • 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。
  • 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后,还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中,才能保证重组DNA分子的增殖

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第一节 重组DNA技术回顾

重组DNA实验中常见的主要工具酶

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第二节 DNA操作技术

1. 核酸凝胶电泳技术

  • 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来,按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术,已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
  • 基本原理:生物大分子在一定pH条件下,通常会带电荷。将其放置到电场中,就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度,与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比,与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数,可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。

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第二节 DNA操作技术

1. 核酸凝胶电泳技术

  • 在生理条件下,核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团,呈离子化状态,DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子,把它们放置在电场当中,会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度,取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。

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第二节 DNA操作技术

1. 核酸凝胶电泳技术

  • 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。
  • 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。
  • 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。
  • 在凝胶电泳中,加入溴化乙锭(EtBr)染料对核酸分子进行染色,然后放置在紫外光下观察,可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位,即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA,也可以被清晰地检测出来。

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第二节 DNA操作技术

溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子,在紫外光照射下,琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光,易于鉴定。

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第二节 DNA操作技术

普通的琼脂糖凝胶电泳,很难分离大于50kb的DNA分子,而要进行超大分子研究,要用到脉冲电场凝胶电泳。

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第二节 DNA操作技术

2. 细菌转化与目标DNA分子的增殖

  • 所谓细菌转化,是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株,接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。
  • 将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗氯化钙溶液中,使细胞膨胀形成原生质球,与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。42℃下做短暂热刺激,复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达,就可涂布于选择性培养基中分离转化子。

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第二节 DNA操作技术

2. 细菌转化与目标DNA分子的增殖

  • 细菌转化方法除了上述的CaCl2还有电击法,利用电脉冲使细胞膜穿孔,外源DNA进入从而实现转化。
  • 利用噬菌体颗粒能够有效将DNA注入到宿主细胞这一特点,科学家又发明了DNA分子的体外包装法。如右图

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第二节 DNA操作技术

3. 聚合酶链式反应

  • 聚合酶链式反应,即PCR技术,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。
  • 基本原理:首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的DNA链的起点,由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步,被不断重复。多次循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA数,即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值是2n。

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第二节 DNA操作技术

3. 聚合酶链式反应

  • 具体过程:
    • 首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(约94℃)环境下加热1min,使双链DNA变性,形成单链模板DNA;
    • 然后降低反应温度(约56℃)冷却1min,使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序列位置上;
    • 最后,72℃左右保温1至数分钟,在DNA聚合酶的作用下,从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸,并沿着模板按5’→ 3’方向延伸,合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后,温度由PCR仪调整,程序完成后可以拿到产物。

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多次循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA数,即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值是2n。多次循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA数,即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值是2n。

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第二节 DNA操作技术

4. 实时定量PCR

  • 具体实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例

增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图 。

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第二节 DNA操作技术

4. 实时定量PCR

  • 一般而言,荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,可以选择在这个阶段进行定量分析。
  • 实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素:
    • Ct值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
    • Ct值与起始模板的关系,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。

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实时荧光定量PCR中荧光化学,荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:
  • TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
  • SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

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TaqMan荧光探针

SYBR荧光染料

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第二节 DNA操作技术

4. 基因组DNA文库的构建

  • 从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段,分别与载体连接,转入受体细菌或细胞,形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子,而且可以繁殖扩增,许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体,就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大,能包含该生物基因组DNA全部的序列,就是该生物完整的基因组文库。
  • 基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定。

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基因组DNA文库的构建过程

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第三节 RNA操作技术

1. 总RNA的提取

  • RNA易遭降解,实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种,主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法(TriZol)。
  • 异硫氰酸胍法(TriZol)原理:
  • TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。

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第三节 RNA操作技术

2. mRNA的纯化

  • mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。
  • 利用mRNA的Poly A结构,试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物,与Poly A杂交,形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体,然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物素-顺磁颗粒(SA-PMPs)结合杂交体,形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物,再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒,最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱,杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离,从而纯化得到mRNA。

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PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图

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第三节 RNA操作技术

3. cDNA的合成

  • cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板,反转录为cDNA,有反转录酶催化,该酶合成DNA时需要引物引导,常用引物是oligo dT。第二链合成是以第一链为模板,由DNA聚合酶催化。

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第三节 RNA操作技术

4. cDNA文库的构建

  • cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。
  • 步骤:在获得高质量的 mRNA 后,反转录合成cDNA,合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断,扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择,常规用的是 λ 噬菌体,这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。

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第三节 RNA操作技术

5. 基因文库的筛选

  • 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种,常用的有:
      • 核酸杂交法
      • PCR筛选法
      • 免疫筛选法

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第四节 基因克隆技术
  • 在多细胞的高等生物个体水平上,人们用克隆(clone)表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子(monozygotic twins)便是属于同一克隆。
  • 在细胞水平上,克隆一词是指由同一个祖细胞(progenitor cell)分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。
  • 在分子生物学上,人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中,使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。

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第四节 基因克隆技术

1. RACE技术

  • 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法,它根据已知序列设计基因片段内部特异引物,由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE,用于扩增3’端的称为3’RACE。
  • 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法显示和基因文库筛选。

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第四节 基因克隆技术

1. RACE技术

  • 5’ RACE
  • 在反转录酶的作用下,以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成
  • RNase混合物降解模板mRNA,纯化cDNA第一条链。
  • 用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP
  • 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增,以期得到目的片段,并可用nest PCR进行检测。

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第四节 基因克隆技术

1. RACE技术

  • 3’RACE
  • 是在反转录酶的作用下,以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。
  • 用RNaseH 降解模板mRNA。
  • 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3‘片段,并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增。

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第四节 基因克隆技术

2. 应用cDNA差示法分析克隆基因

  • cDNA差示分析法(representational difference analysis, RAD)充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板,仅以线形形式扩增单链模板的特性,通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法,特异性扩增目的基因片断。

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第四节 基因克隆技术

3. Gateway大规模克隆技术

  • Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切出反应。整合反应是由Int (integrase)和 IHF(Integration Host Factor)催化的。attB和attP之间的重组整合的噬菌体基因组DNA的5’和3’端含有attL和 attR位点。 切出的重组反应需要IHF, Int 和 Xis蛋白的参与。在插入E. coli 基因组DNA 的的噬菌体基因组DNA的5’ 和3’ 端的attL和 attR位点发生位点特异性的重组,重新在形成lambda DNA 的attP位点和E. coli 基因组DNA 的attB位点。

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第四节 基因克隆技术

3. Gateway大规模克隆技术

  • 相对酶切构建载体来说,该技术具有需时短、操作简单、易于各实验室交流的特点,即只需通过简单、高效的BP 和LR 反应就可实现把PCR 产物定向转入克隆质粒和表达质粒,实现PCR 产物在各种质粒间的转移。

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第四节 基因克隆技术

4. 基因的图位克隆法

  • 所有具有某种表现型的基因都可通过该法克隆得到。首先,通过构建遗传连锁图,将目的基因定位到某染色体的特定位点,并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。
  • 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析,找出与目的基因距离最近的RFLP标记,通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来

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第五节 蛋白质组与蛋白质组学技术

蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否,很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析,往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此,发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。

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第五节 蛋白质组与蛋白质组学技术

1. 双向电泳技术

  • 蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。
  • 双向电泳( 2-DE )由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化。
  • 双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离,至各自的等电点;随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离。
  • 首先,极高的重复性使有机体的参考图谱,可通过Internet获得,来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次,高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术

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pH10

IEF

pH3

SDS

第五节 蛋白质组与蛋白质组学技术

1. 双向电泳技术

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第五节 蛋白质组与蛋白质组学技术

2. 蛋白质印迹法

  • 分子生物学中最常用的蛋白质技术可能是蛋白质印迹法(Western bloting),又称免疫印迹法(immunobloting)。
  • 原理:经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

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第五节 蛋白质组与蛋白质组学技术

2. 蛋白质印迹法

  • 免疫印迹法程序可分为五个部分:
    • 蛋白样品的制备
    • 经过SDS-PAGE分离的样品
    • 分离的蛋白转移到膜载体上,转移后将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附
    • 用固定在膜上的蛋白作为抗原,与对应的非标记抗体(一抗)结合
    • 洗去未结合的一抗,加入酶偶联或放射性标记的二抗,通过显色或放射自显影来检测蛋白。

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第五节 蛋白质组与蛋白质组学技术

2. 蛋白质印迹法

  • 用于二级抗体的检测有以下三种:
    • 放射性标记的抗体
    • 与酶偶联的抗体
    • 与生物素相偶联的抗体

3. 蛋白质质谱分析技术

    • 蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定电泳后分离的蛋白质。该技术是一种超灵明的技术,从理论上说,仅需少量样品就可获得误率低于百万分之一的结果。

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