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SEMINARIO 7 Maestría en Biología Molecular médica

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SEMINARIO 7 Maestría en Biología Molecular médica. Miguel Alcón Álvarez Valeria Descalzi Graciela Klein Sergio Morales Marcelo Regueiro. Receptor de Glucocorticoides (GR ).  Factor de Transcripción activado por ligando  Al unirse a esteroides, interacciona con

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Presentation Transcript
seminario 7 maestr a en biolog a molecular m dica

SEMINARIO 7Maestría en Biología Molecular médica

Miguel Alcón Álvarez

Valeria Descalzi

Graciela Klein

Sergio Morales

Marcelo Regueiro

receptor de glucocorticoides gr
Receptor de Glucocorticoides (GR)

Factor de Transcripción activado por

ligando

 Al unirse a esteroides, interacciona con

sitios específicos del genoma a través de

sub- unidades mediadoras regulatorias,

pudiendo activar o reprimir la expresión

génica

estructura del receptor glucocorticoide

NT AD1 DBD LBD AD2 CT

NT: EXTREMO N- TERMINAL

CT: EXTREMO C- TERMINAL

AD1: DOMINIOS DE ACTIVACION 1

AD2 :DOMINIOS DE ACTIVACION 2

LBD: DOMINIO DE UNION AL LIGANDO

DBD: DOMINIO DE UNION AL DNA

Estructura del Receptor Glucocorticoide
slide5

Sub-Unidades Mediadoras Regulatorias

Co-activadores

Complejo Mediador

Complejo SWI/SNF

Proteínas p160

●SRC1

●TIF2/GRIP1

●Otras

Factores de remodelación de la Cromatina

Puente molecular entre los DA y la RNA Pol II

slide6

MED14 and MED1 DifferentiallyRegulateTarget-Specific Gene Activation by the Glucocorticoid Receptor

Weiwei Chen, Inez Rogatsky, and Michael Garabedian

Departments of Microbiology (M.J.G.), Urology (M.J.G.), and Pharmacology (W.C.) and New York University Cancer Institute, New York University School of Medicine and Cornell University School of Medicine

Molecular Endocrinology, March 2006, 20 (3):560-572

introducci n
Introducción

 Las sub-unidades MED 14 y MED 1

interactúan con los GR a través de sus

dominios AD1 y AD2

Hittelman AB, EMBO J, 18:5380-5388

 Se han identificado de 10 genes target

inducibles por GR presentes en células

de osteosarcoma que difieren en sus

requerimientos por AD1 y AD2

RogatskyI,Proc Natl Acad Sci USA 100:13845-13850

slide8

Hipótesis

Las subunidades MED14 y MED1del complejo mediador regulan en forma diferenciada la activación transcripcional, gen específica, a través de su interacción con los receptores de glucocorticoides

slide9

Métodos

Se midió la expresión del mRNA generado a partir de la inducción con dexametasona de 4 genes target de GR presentes en células de osteosarcoma:

●IGFBP1 (IGF-Binding protein 1)

● IRF8 (Interferon regulatory factor 8)

● GILZ (GC-inducible leucine-zipper protein)

●LAD 1(ladinin protein 1)

Medición en función del tiempo y dosis acumulativas de dexametasona

m todos
Métodos

Se midió la expresión génica en presencia o ausencia de dexametasona luego del silenciamiento de la expresión de MED 1 y MED 14,utilizando siRNAs

 Se identificó la secuencia genómica de la zona regulatoria a la que se unían GR, MED 1 y MED 14

m todos1
Métodos

Se midió la expresion génica en inducida por dexametasona luego del silenciamiento de la expresión de TIF2, utilizando siRNA

 Se evaluó el reclutamiento de RNA polimerasa II mediado por GR en ausencia de sub- unidades regulatorias

t cnicas utilizadas
Técnicas Utilizadas

 Cultivo Celular/ Transfecciones Trans.

 Real Time – PCR

 siRNA / RT-PCR

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

 Western Blott

materiales
Materiales

 Cultivos de células de osteosarcoma

humano U2OS-hGR que expresan en

forma estable el wild type – GR

 RNAs de Interferencia (iRNAs)

● 2 siRNA para MED 14 (siMED14)

● 4 siRNA para MED 1 (siMED1)

● 1 siRNA específico para Luciferasa (siCTRL1)

● 1 siRNA no específico – control – (siCTRL2)

● 1 siRNA variante resistente MED14 (MED14v)

materiales1
Materiales

Plásmidos para Transfecciones Transcientes

pRK5-HA-MED 14

pRK5-HA-MED 14 v

pRK5-HA-MED1

 p-GAL4-Luciferasa

GAL4-VP16

Células transfectadas en medio libre de suero usando 10 μl de Lipofectamina y 10 μl de reactivo Plus (Invitrogen)

slide15

Materiales

 Anticuerpos para técnicas de ChIP (1) e Inmunoblotting (2)

1- Ac policlonal (conejo) contra MED14 (1)

2- Ac monoclonal (ratón) contra MED1 (2)

3- Ac policlonal (conejo) contra MED1 (1)

4-Ac contra receptor glucocorticoideo (1)

slide16

Materiales

 Bases de DatosConsultadas

an lisis estad stico
Análisis Estadístico

●Se utilizó el test deStudent

●Los resultados fueron expresados en media ± SD

●Un valor de p < 0.1 fue considerado significativo

diferencias en la cin tica de inducci n y curva dosis respuesta frente a dexametasona
DIFERENCIAS EN LA CINÉTICA DE INDUCCIÓN Y CURVA DOSIS / RESPUESTA FRENTE A DEXAMETASONA

Se analizaron 4 genes regulados por glucocorticoides (GR) en células de osteosarcoma humano U20S.

  • IRF8
  • LAD1
  • IGFBP1
  • GILZ Estructura básica de GR
slide20

Se analizaron estos 4 genes los cuales son fuertemente inducibles por glucocorticoides y presentan diferentes requerimientos para AF1 o AF2.

  • La acumulación de mRNA tiempo y dexametasona dependiente, sugirieron estos diferentes requerimientos de cofactores para la expresión génica receptor-dependiente.
slide21

La expresión de los genes investigados se determinó por Real Time - PCR.Se observa que existe una relación temporal y dosis dependiente ( dedexametasona) en la expresión de todos los genes en estudio.Fig. 1 Inducción de genes dianapor glucocorticoides ( temporal y ligando dependiente)

an lisis del gr fico
ANÁLISIS DEL GRÁFICO
  • Fig. 1A. Concentración de mRNA de IGFBP1 y GILZ inducidos 15´ con dexametasona, mRNA de LAD1 y IRF8 30´ y 60´ después.
  • LAD1, IGFBP1 Y IRF8 continúan incrementándose exponencialmente a los 90´, mientras que el mRNA de GILZ no se acumula significativamente.
  • Relación de la expresión basal de mRNA:

GILZ > IRF8 > IGFBP1 > LAD1

  • Fig.1B. GILZ, IGFBP1 y LAD1 requirieron dosis bajas para su inducción. IRF8 requirió dosis más altas de dexametasona.
conclusiones
CONCLUSIONES
  • Bajas concentraciones de ligandos son necesarios para la activación transcripcional de GILZ, LAD1 y IGFBP1 respecto a IRF8.
  • La cinética gen específica y la respuesta a diferentes dosis de dexametasona, sugieren diferentes mecanismos involucrados en la inducción de GILZ, IGFBP1, LAD1 y IRF8 por GR en células U20S.
c mo interviene med14 y med1 en la activaci n de genes diana
¿CÓMO INTERVIENE MED14 Y MED1 EN LA ACTIVACIÓN DE GENES DIANA?
  • Habiendo demostrado mediante transfección transiente que MED14 y MED1 interactúan con GR a través de AF1 y AF2 respectivamente.
  • Se silencia MED14 y MED1 usando pequeños RNA de interferencia (siRNA)
  • Se mide la activación transcripcional de los mRNA de los genes estudiados, en ausencia y presencia de dexametasona mediante Real-Time PCR:

- LAD1

- IGFBP1

- GILZ

- IRF8

an lisis cuantitativo de mrna inducible por gr mediante real time pcr
ANÁLISIS CUANTITATIVO DE mRNA inducible por GR mediante Real-Time PCR
  • Se usaron células U20S-hGR transfectada con siRNA contra MED14 (siMED14), MED1 (siMED1), control con siRNA luciferasa (siCTRL) y RNA total.
  • Reducción de los niveles de MED14 y MED1 respecto al control usando siRNA.
determinaci n de prote nas por inmunoblotting western blot
Determinación de proteínas por inmunoblotting (Western Blot)
  • A las 48 horas se extraen proteínas y se las identifican utilizando anticuerpos contra MED14, MED1, SCR-1, GR y Tubulina.
respuesta de los genes gr al silenciamiento de med14 ymed1
RESPUESTA DE LOS GENES GR AL SILENCIAMIENTO DE MED14 YMED1

UTILIZANDO

Real-Time PCR

  • Células U20S transfectadas con siRNA (siMED14, siMED1 y siCTRL1 luciferasa)
  • C: Inducidas con 100 nm de dexametasona (2 horas)
  • D: Inducidas con etanol

(2 horas)

resultado
RESULTADO
  • La regulación que ejercen los GR sobre los genes examinados permiten su agrupación en diferentes clases.
  • Clase 1 → IGFBP1 MED14 > MED1
  • Clase 2 → LAD1 – IRF8 MED14 = MED1
  • Clase 3 → GILZ Independiente de

MED14 y MED1

med14 y med1 son reclutados al promotor de genes diana de gr
MED14 y MED1 SON RECLUTADOS AL PROMOTOR DE GENES DIANA DE GR.
  • OBJETIVO:

Identificación de secuencias genómicas en regiones regulatorias de IGFBP1, GILZ, IRF8 y LAD1 ocupados por GR, MED14 y MED1 en células U20S.

  • Técnica utilizada:

Inmunoprecipitación

cromatínica (ChiP Assay)

gr med14 y med1 son reclutados hacia los genes gr dexametasona dependiente
GR, MED14 y MED1 son reclutados hacia los genes GR (dexametasona dependiente)
  • Descripción esquemática de las regiones regulatorias GILZ, IGFBP1 y IRF8.
  • Regiones negras: Sitios de unión a GR (Primers GL-3, IG-1 e IR-1)
  • Las regiones rayadas no contienen GREs y sirven como control negativo para el ensayo de ChiP.
  • Las flechas representan sitios de inicio transcripcional.
reclutamiento de gr med14 y med1 hacia gilz igfbp1 y irf8
RECLUTAMIENTO DE GR, MED14 y MED1 hacia GILZ, IGFBP1 y IRF8
  • Células U20S tratadas con etanol o dexametasona durante 2 horas→ cross linked con formaldehído.
  • ChiP assay realizado con anticuerpos contra GR, MED14 y MED1. IgG de conejo como control negativo.
  • Los sitios de unión a GR fueron amplificados por PCR usando Primers gen-específicos.
  • El producto de PCR corrido en gel de agarosa.
  • Visualizado con bromuro de etidio.
  • Cuantificado mediante Health Image 1.63 Software.
producto del pcr corrido en gel de agarosa
Producto del PCR corrido en gel de agarosa.
  • GR, MED14 y MED1 se

asocian a los GREs en

regiones regulatorias

de IGFBP1, GILZ y IRF8

(dependientes de

dexametasona)

From mend.endojournals.org on July 15, 2006

slide33
El reclutamiento de GR fue usado como valor basal.La cantidad de MED14 y MED1 en relación a GR fue determinada entre los genes.
  • La señal del producto de PCR representando el 1% del input fue arbitrariamente indicado como 1.
  • La afinidad de MED14 hacia IGFBP1 y IRF8 comparada con GR fue mayor a la observada para la región regulatoria GILZ.
  • IGFBP1>IRF8>>GILZ
  • Sensibilidad de los genes al silenciamiento de MED14:
  • IGFBP1~IRF8>GILZ
  • El reclutamiento de MED1 comparado con GR fue similar entre genes.
conclusiones1
CONCLUSIONES

MED14 es un factor GR hormona dependiente determinante para la transcripción de IGFBP1 y IRF8 pero no de GILZ.

cu les son las otras v as de activaci n de gilz
¿Cuáles son las otras vías de activación de GILZ?
  • La inducción de GILZ requiere factores intermediarios transcripcionales (TIF)
  • PROTEÍNAS p160

Familia de cofactores que confieren actividad transcripcional por GR y otros receptores de hormonas esteroides como:

- SRC1 (Coactivador 1 de receptor de esteroides)

- TIF2 (Factor 2 intermediario transcripcional) Proteína de

interacción con GR = GRIP1

- Activador de hormona tiroidea

- Coactivador 3 asociado a receptor nuclear

  • La p160 modifica la estructura cromatínica a través de la acetilación o metilación de histonas vía asociación a cAMP.
simed14 y simed1 tienen distinto efecto sobre la inducci n de igfbp1 irf8 lad1 y gilz
siMED14 y siMED1 tienen distinto efecto sobre la inducción de IGFBP1, IRF8,LAD1 y GILZ.
  • Se examinaron las consecuencias de reducir la expresión de TIF2 sobre estos genes.
  • TIF2 parece ser la más abundante p160 en U20S.
  • Basados sobre estudios cinéticos, fue analizado el reclutamiento del mediador versus el complejo p160.
slide37
La inducción mediada por GR de GILZ requiere TIF2/GRIP1.La inducción dexametasona dependiente de la expresión de GILZ es mediada por TIF2
  • La introducción de siTIF2

dentro de células U20S-hGR,

reduce la expresión del mRNA

de TIF2 un 75% comparadas

con células control transfectadas

con siRNA (siCTRL)

  • Las células fueron inducidas

con 100 nm de dexametasona

por 2 horas y analizado por

real-time PCR.

an lisis de la inducci n de gr dexametasona dependiente
Análisis de la inducción de GR dexametasona dependiente.
  • IRF8 y IGFBP1 no fueron

afectados por la down-

regulation DE TIF2.

  • LAD1 fue levemente

reducido.

  • GILZ es significativamente

reducido por siTIF2.

Estos resultados sugieren que p160 TIF2 confieren activación transcripcional GR- dependiente de los genes GILZ.

slide39
RECLUTAMIENTO GLUCOCORTICOIDE DEPENDIENTE DE RNA POLIMERASA II HACIA LOS PROMOTORES Y ESTIMULADORES DE GILZ

La inducción de GILZ parece ser independiente de MED14 y MED1.

  • GR unido a la región GREs ¿Puede reclutar a la RNA polimerasa II?

ENSAYO

Para contestar esto, se comprueba la unión de la RNA polimerasa ll a los promotores y GREs de GILZ y IGFBP1 mediante ChiP assay.

slide40

Representación esquemática de las regiones regulatorias de GILZ y IGFBP1 mostrando la localización del par de primers usados en el ChiP assay.

  • PRIMERS GL-3 y IG-2: sitios de unión a GR
  • PRIMERS GL-4 y IG-2: regiones usadas como control negativo para ChiP assay.
  • TSS: Promotores.
  • FLECHAS: Dirección de la transcripción.
uni n de la rna polimerasa ii a las regiones regulatorias de gilz y igfbp1
Unión de la RNA polimerasa II a las regiones regulatorias de GILZ y IGFBP1.
  • Células U20S-hGR fueron tratadas con vehículo o dexametasona durante 2 horas y analizado mediante ChiP assay usando un par de primers gen específicos.
los productos del pcr fueron corridos sobre un gel de agarosa y visualizados con bromuro de etidio
Los productos del PCR fueron corridos sobre un gel de agarosa y visualizados con bromuro de etidio.
  • La RNA polimerasa II se recluta hacia el promotor y el enhancer de GILZ, pero no a las regiones aledañas.
  • Los GR unidos a GREs pueden llevar a la RNA polimerasa II hacia el promotor a través de un “loop” del DNA.
los productos del pcr obtenidos mediante chip assay son cuantificados
Los productos del PCR obtenidos mediante ChiP assay son cuantificados
  • Mediante ChiP assay se determinó que la Polimerasa II ocupa la región regulatoria del GILZ.
conclusi n
CONCLUSIÓN:
  • Los GR a nivel del gen GILZ no requieren un mediador y reclutan directa o indirectamente a la RNA polimerasa II, mientras que en el gen IGFBP1, los GR si requieren de un mediador para unirse a la enzima.
antecedentes
ANTECEDENTES
  • Los coactivadores MED 14 y MED 1 son subunidades mediadoras implicadas en la regulación transcripcional a través de receptores de glucocorticoides (GR)
  • GR poseen 2 dominios de activación de función:

- N-terminal activation funtion 1 (AF1)

- C-terminal activation funtion 2 (AF2)

  • Estudios previos han revelado que los coactivadores MED1 y MED14, permiten a los GR regular la transcripción vía RNA polimerasa II.
  • Siempre se realizaron estudios sobre genes reporteros artificiales.
genes regulados por receptores de glucocorticoides gr
GENES REGULADOS POR RECEPTORES DE GLUCOCORTICOIDES (GR)
  • IGFBP1 (Factor de crecimiento insulino-simil 1)
  • IRF8 (Interferon regulatory factor 8)
  • GILZ (GC-induced leucine-zipper protein)
  • LAD1 (cytoskeletal anchoring activity)

Difieren en sus requerimientos por los sitios de

activación AF1 y AF2.

No son los únicos genes cuya expresión es regulada por receptores de glucocorticoides.

conclusiones generales
CONCLUSIONES GENERALES

En este estudio se compararon los requerimientos de 2 (dos) coactivadores de GR: MED14 y MED1 sobre múltiples genes GR dependientes, a través de diferentes elementos regulatorios (AF1, AF2 y TIF2).

  • La eliminación de MED14 afecta la inducción mediada por GR sobre algunos promotores (IGBP1, IRF8 y LAD1) pero no sobre otros (GILZ).

ENTONCES:

  • GILZ no se ve afectado por la disminución de MED14, MED1 o ambas, a pesar de ser regulado por GR.
  • La inducción mediante GR sobre LAD1, IRF8 y IGFBP1 son mediador dependiente. No obstante, los GR usan diferentes mediadores para el control de la transcripción gen-específica.
expresi n de mrna en diferentes genes y su relaci n a factores intermediarios
Expresión de mRNA en diferentes genes y su relación a factores intermediarios.
  • LAD1, IRF8 y IGFBP1 no fueron

afectados por la down- regulation

de TIF2, mediante siTIF2 en U20S.

TIF2 (Factor 2 intermediario

transcripcional)

TIF2 es la más abundante de la

familia de cofactores p160 en

U20S (que modifica la

estructura cromatínica)

  • GILZ es significativamente

reducido por siTIF2.

Estos resultados sugieren que p160 /TIF2 confieren activación transcripcional GR- dependiente a los genes GILZ.

modelos de activaci n de gr de los genes estudiados
MODELOS DE ACTIVACIÓN DE GR DE LOS GENES ESTUDIADOS
  • IGFBP1: GR se une al complejo mediador vía MED14 a través de AF1. Este complejo recluta a la maquinaria transcripcional de la RNA Pol II (RNAPII)que se une a la región promotora del gen e inicia la transcripción.
  • IRF8: recluta a MED14 no vía AF1 o en forma indirecta por otro FT.
  • GILZ: GR utilizan TIF2. Remodela la cromatina en los GREs y recluta RNAPII independiente del mediador.
nuevos conocimientos nuevos interrogantes
NUEVOS CONOCIMIENTOS.NUEVOS INTERROGANTES.
  • El mediador es importante en la actividad y selectividad en promotores de GR.
  • Algunos genes GR dependientes (GILZ), pueden prescindir del mediador para su activación.
  • Otros genes (IGFBP1 o IRF8) sufren una regulación dependiente de la concentración de mediadores (MED 14 o MED1).
  • MED14 está ligado al cromosoma X.
  • Esto sugiere que las mujeres presentan niveles más altos de MED14 que los hombres.
hip tesis
HIPÓTESIS
  • Existen diferencias en la expresión de genes regulados por GR en relación al género.

Esta hipótesis está siendo actualmente testeada.

slide52
MUCHAS GRACIAS

Maestría en Biología Molecular Médica

Noviembre 2006