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乙型肝炎病毒基因组变异研究几个热点问题

乙型肝炎病毒基因组变异研究几个热点问题. 侯金林 孙 剑 王战会 骆抗先. 广州第一军医大学南方医院. 乙型肝炎病毒基因组变异. HBV 基因型特点 前 C/C 基因变异. 发病机制. 临床诊断. HBV 变异. S 基因变异. HBV 基因组与干扰素应答. 抗病毒治疗. P 基因变异与核苷类似物耐药. 乙型肝炎病毒基因组变异. HBV 基因型特点. 发病机制. 临床诊断. HBV 变异. 抗病毒治疗. HBV 基因型的地域性分布特点. HBV 基因异质性，8个基因型 （ A— H ） HBV 基因型的地域性分布特点.

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乙型肝炎病毒基因组变异研究几个热点问题

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  1. 乙型肝炎病毒基因组变异研究几个热点问题 侯金林 孙 剑 王战会 骆抗先 广州第一军医大学南方医院

  2. 乙型肝炎病毒基因组变异 HBV 基因型特点 前C/C基因变异 发病机制 临床诊断 HBV变异 S 基因变异 HBV基因组与干扰素应答 抗病毒治疗 P基因变异与核苷类似物耐药

  3. 乙型肝炎病毒基因组变异 HBV 基因型特点 发病机制 临床诊断 HBV变异 抗病毒治疗

  4. HBV基因型的地域性分布特点 • HBV基因异质性，8个基因型 （A—H） • HBV基因型的地域性分布特点 • B and C - 远东、亚洲 • A – 北欧、美国 • D – 地中海

  5. HBV亚型和基因型的关系 HBV基因型 HBV亚型 A型 adw2和ayw1 B型 adw2和ayw1 C型 adr、ayr和adw2 D型 ayw2和ayw3 E型 ayw4 F型 adw4、ayw4和adw2 G型 adw2

  6. HBV前S基因PCR及酶切电泳图

  7. 中国大陆地区HBV基因型分布 A Others 1 % B 4 % D 30 % 8 % C 57 % n = 694

  8. 地区 小计 A B C D B+C B+D C+D 待分型 福建 111 4 48 33 9 2 1 1 13 山东 101 1 86 8 4 2 云南 85 1 38 34 9 3 广东 176 97 76 3 海南 70 16 49 4 1 宁夏 100 90 10 新疆 40 3 27 10 香港 11 3 4 4 合计 694 6 205 399 54 9 1 5 15 中国大陆部分地区HBV基因型分布（n = 694）

  9. Phylogenetic tree of 30 strains of HBV genotype D (Neighbour Joining) AF121239 AF121242 AF121240 Y07587 X02496 X97849 AF121241 AF151735 X80925 M32138 X97848 X80924 X72702 AF280817 X80926 Z35716 AB033558 AF043594 AB033559 X68292 AB048701 X65259 X65258 AB048702 X85254 AB048703 X65257 U95551 J02203 AJ131956

  10. HBV基因型/变异与干扰素应答 148 例HBeAg 阳性慢性乙型肝炎病人 Europe (n=103)China (n=45) Age (years) 36 ± 14 30 ± 8 ALT (xULN) 3.9 ± 3.1 7.0 ± 7.1 IFN-a (total dose) 480 MU / 16 wks 960 MU/ 32 wks 468 MU / 26 wks Responders (n) 42 22 Non-responders (n) 61 23

  11. 欧洲和广东地区HBV基因型分布 E F G A D C B Total (n=148) 6% 35% 46% 36% 13% 3% 64% Europe (n=103) China (n=45)

  12. C基因启动子、前C 终止变异与干扰素应答 after Rx before Rx Core Promoter T1762A1764 Precore Stop Codon A1896 % of patients p = 0.005 Resp. Non-Resp. Resp. Non-Resp.

  13. HBV 基因型与C基因启动子和前C 终止变异 before Rx Core Promoter T1762A1764 after Rx p = 0.001 % of patients A (n=42) B (n=17) C (n=40) D (n=33) Precore Stop Codon A1896

  14. 75 50 25 0 1 31 61 91 121 151 181 75 (p=0.0004) 50 25 0 1 31 61 91 121 151 181 (p=0.007) (p=0.002) 不同HBV基因型核心基因的变异性 A= 1.7±1.9 aa/patient (n=24) D= 4.0±2.3 aa/patient (n=24) % of patients with mutations B = 3.7±2.1aa/patient(n=12) C= 3.3±2.5 aa/patient (n=27) HBV Core amino acid position

  15. before Rx after Rx HBV 核心基因变异与IFN-a 应答 p = 0.0007 no aa changes (n=51) (n=36) p = n.s no of acquired aa mutations (n=28) (n=28) Responders Non-Responders

  16. HBV主要基因型特点总结 Genotype BCP A1896 No. of Core Changes IFN responsiveness A B C D +++ 1.4 +? 6.0 +? 4.8 + 4.1

  17. 结论 • HBV基因型A对标准干扰素治疗应答率较其它基因型高，这可能与A基因型分子结构特点相关. • 干扰素治疗后的HBeAg血清转换不是因为获得A1896变异累积的结果. • 干扰素治疗失败不是因为治疗过程中获得了HBV C基因变异株的结果.

  18. 乙型肝炎病毒基因组变异 发病机制 临床诊断 HBV变异 P基因变异与核苷类似物耐药 抗病毒治疗

  19. 乙型肝炎病毒核苷类似物耐药性 • 发生在什么部位？如何命名的？ • 发生率多高？ • 有何意义？（与肝炎活动、病毒反跳、HBeAg阴转、重型化） • 病人发生YMDD突变后如何处理？

  20. HBV多聚酶的突变 与拉米夫定反应降低相关的2个主要位点 突变型: 代偿型 主要类型 密码子 # 528 552 氨基酸F L L A Q …...//…… Y M D D M V I M I 很少检测到其他位点的变异. 关于其他位点变异株的意义还远未被阐明. 这些位点的突变包括: L428V/I, L430M, F514L, A529T

  21. 乙型肝炎病毒耐药命名 preS1 preS2 HBsAg tp spacer rt rt F A B C D E rh 现行命名系统 A 385-395 423-439 511-L528M-537 545-M552-555 578-589 595-605 B/C/F 383-393 421-439 509-L526M-535 546-M550-556 576-587 593-603 D 372-382 410-426 498-L515M-524 535-M539-545 565-576 582-592 E/G 382-392 420-436 508-L525M-534 545-M549-555 575-586 592-602 标准命名系统 A 到 G 37-47 75-91 163-L180M-189 200-M204-210 230-241 247-257 Stuyver et al. Hepatology 2001

  22. 乙型肝炎病毒核苷类似物耐药性 • 发生在什么部位？如何命名的？ • 预测因素、发生率多高？ • 有何意义？（与肝炎活动、病毒反跳、HBeAg阴转、重型化） • 病人发生YMDD突变后如何处理？

  23. 预测因素 • 体重 • 基线ALT • 基线HBV DNA • HBV基因型？ • 治疗中HBV DNA 下降水平〈103拷贝/毫升血清

  24. YMDD 变异 发生率 • 在治疗的前36周内，PCR方法极少检测到 (检测敏感度 = 500 拷贝/mL)变异株 • 在经拉米夫定治疗后的HBeAg阳性患者中检出YMDD 变异HBV的概率为: • 1 年 = 24% (Lai et al., 2001) • 2 年 = 38% (Liaw et al., 2000) • 3 年 = 49% (Leung et al., 1999) • 4 年 = 66% (Chang et al., 2000) • 出现YMDD 变异株并不等同于临床耐药

  25. 乙型肝炎病毒核苷类似物耐药性 • 发生在什么部位？如何命名的？ • 发生率多高？ • 有何意义？（与肝炎活动、病毒反跳、HBeAg阴转、重型化） • 病人发生YMDD突变后如何处理？

  26. 台湾地区拉米夫定治疗过程中YMDD突变 病例： 55 例慢性乙型肝炎 治疗方案：拉米夫定100毫克，104 周. 结果：55%（32/55）YMDD突变；有YMDD突变者90% ALT升高；45%出现YMDD 24周后急性发作；24% ALT大于10倍正常值以上。3例失代偿。 结论：YMDD突变后HBV DNA反跳引起肝炎活动， 有YMDD突变病例仍可发生HBeAg转阴。 Liaw et al. 1999

  27. 0 13 26 39 52 65 78 91 104 117 130 143 156 周 广州南方医院检测YMDD耐药策略 临床耐药 Clinical Resistance n=20 ALT flare 表型耐药 Phenotypic 基因型耐药Genotypic n=32 YMDD变异株 n=198 YMDD screen By RFLP at baseline and every 4 weeks Mutations outside YMDD in vitro study

  28. HBV DNA level at the time of appearance of YMDD mutant VS baseline 108 HBV DNA level (Copies/ml) 107 Baseline 106 After emergence of YMDD mutant 105 104 P=0.279 103 102 101

  29. ALT level at the time of appearance of YMDD mutant VS baseline 350 327.7 300 Baseline ALT 250 P=0.046 ALT level ALT after emergence of YMDD mutant 200 150 117.8 85.6 100 76.4 P=0.353 50 HBeAg positve N=13 HBeAg negative N=6

  30. ALT IU/L HBV DNA pg/ml 出现 YMDD突变后肝功能失代偿（1） Biopsy Biopsy 1400 900 800 1200 YMDD YIDD 700 1000 600 800 500 400 600 300 400 200 200 100 0 0 99.7.5 01.8.6 02.4.6 02.4.9 02.7.5 98.5.18 98.11.8 00.12.6 02.4.18 02.6.10 02.6.17 02.6.19 02.6.26 02.7.24 02.8.21 02.9.27 99.12.19 HBeAg Positive HBeAg Negative LAM IFN

  31. 出现 YMDD突变后肝功能失代偿（2） YMDD 600 140 YVDD YMDD YVDD 120 500 100 400 80 300 60 200 40 100 20 0 0 99.5.5 01.2.9 01.3.6 01.3.7 01.8.6 00.1.30 00.5.15 00.6.20 01.2.26 01.3.14 01.3.22 01.3.29 01.4.17 01.7.23 01.9.21 01.10.8 02.1.28 01.10.26 01.11.14 01.11.23 01.12.20 ALT IU/L 120 TBIL umol/L 100 80 HBV DNA Pg/ml 60 40 20 0 99.5.5 01.2.9 01.3.6 01.3.7 01.8.6 00.1.30 00.5.15 00.6.20 01.2.26 01.3.14 01.3.22 01.3.29 01.4.17 01.7.23 01.9.21 01.10.8 02.1.28 01.10.26 01.11.14 01.11.23 01.12.20 HBeAg Positive LAM LAM

  32. 发生YMDD突变后的临床模式 肝功能失代偿型（期） ALT持续 低水平异常型（期） HBV DNA ALT ALT 持续正常型（期）

  33. Quasispecies of polymerase gene A Domain B Domain C Domain D DomainAB014388 (C) SNLSWLSLDVSAAFYH YSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQ AFSYMDDVVLG LSLGIHLNPNKTKRW AB010289 (B) ---------------- ------------------------- ----------- V-----V—H----- AB048701 (D) ---C------------ ------------------------- ----------- --------------- 6A ----------Y----- ------------------------- ----------- --------------- 6-1 ---------------- ------F------------------ ----I------ ---------H----- 6-6 -----I---------- ------------------------- ----V------ --------------- 6-7 ----------P----- --------------E---------- ----------- --------------- 6-14 ---------------- --------------E---------- ----------- --------------- 6-20 ---------------- --------------E---------- ----------- --------------- 14A ---------M------ ------------------------- ----------- --------------- 14-1 ---------M------ ------------------------- ----I------ --------------- 14-2 ---------M------ ------------------------- ----V--A--- -----------A--- 14-3 ---------------- ------------------------- ----I------ --------------- 14-8 ---------M------ ------------------------- ----------E --------------- 14-9 ---------------- ----------------C-------- ----------- ---------------

  34. Quasispecies of polymerase gene A Domain B Domain C Domain D DomainAB014388 (C) SNLSWLSLDVSAAFYH YSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQ AFSYMDDVVLG LSLGIHLNPNKTKRW AB010289 (B) ---------------- ------------------------- ----------- V-----V—H----- AB048701 (D) ---C------------ ------------------------- ----------- --------------- 1A ---------------- ------------------------- ----------- ---------H----- 1-1 -----I---------- ----T-----------C-------- ----V------ --------------- 1-2 -----I---------- ------------------------- -S--I------ ---------H----- 1-3 --------GA------ ------------------------- ----I------ --------------- 1-9 ---------------- ------------------------- ----I------ --------------- 1-10 ---------------- --------------E-C-------- ----------- --------------- 9A ---------------- ------------------------- ----------- ------------Q-- 9-1 ---------------- ------------------------- ----V------ --------------- 9-2 -------M-------- ------------------------- ----I------ --------------- 9-3 ---------------- -P--------------------M-- ----V------ --------------- 9-11 -------M-------- ------------------------- ----I--M--- --------------- 9-12 ---------------- --------------E-C-------- ----------- --------------- 5A ---------------- ------------------------- ----------- --------------- 5-1 ---P------------ --------------E-C-------- ----V------ --------------- 5-2 ---------------- ------------------------- ----I------ --------------- 5-3 ---------------- ----------E-------------- ----I------ --------------- 5-6 ---------------- ------------------------- ----------- --------------- 5-7 ---------------- --------------E---------- ----------- ---------------

  35. 克隆一种新的HBV毒株（G518E / G520C） Acknowledgement: This plasmid was a gift from Prof. Wang Yuan, Institute of Biochemistry, China Academy of Science References: Biochem Pharmacol. 1999 Jun 15;57(12):1351-9. Biochem Pharmacol. 1998 May 15;55(10):1567-72

  36. 乙型肝炎病毒核苷类似物耐药性 • 发生在什么部位？如何命名的？ • 发生率多高？ • 有何意义？（与肝炎活动、病毒反跳、HBeAg阴转、重型化） • 病人发生YMDD突变后如何处理（探讨）？

  37. Withdraw or Continue? 停药？继续治疗？ 非常困难的选择？对病人的利益？

  38. ALT复升的处理 • ALT5XULN，HBV DNA低于治疗前水平可继续使用拉米夫定，加强保肝治疗 • 治疗超过6个月，ALT5XULN，HBV DNA高于治疗前水平或持续不降，可停用拉米夫定或改用其他抗病毒治疗 • ALT=5XULN，或合并总胆红素等生化指标明显异常，有肝脏失代偿迹象*，不能轻易停药 * 肝脏失代偿：血清总胆红素5mg/dL (85.5umol/L)；血清白蛋白35g/L；凝血酶原活动度60%(或较正常对照延长4秒)；出现明显失代偿的临床表现，如明显厌食、乏力、恶心和呕吐、腹水、自发性腹膜炎、黄疸(进行性加深)、皮肤粘膜出血倾向、肝脏进行性缩小、肝性脑病及上消化道出血等。 2001年拉米夫定临床应用专家共识 中华肝病杂志

  39. 阿的福韦体内外均对LAM和FCV耐药毒株有效 • 体外: 阿的福韦对LAM和FCV耐药毒株有效. • 体内：阿的福韦治疗LAM耐药病例，76例疗程6个月,HBV DNA下降3.8个对数值；44例疗程12个月,HBV DNA下降4.6个对数值。 Xiong et al. 2001 AASLD

  40. 贺普丁治疗需注意的问题 • 充分获取治疗基线完整资料 Avoiding blind treatment without liver biopsy • 充分达成医患公识——病人用药知情 • 临床医生充分权衡治疗带来的利益和风险 • 严格按照适应症选择病人 • 密切观察病人 • 严格及时处理治疗中的病情波动：出现耐药后停药或改用干扰素诱发肝炎加重的机会可能比继续用药大？无结论，需要进一步研究 （教训：Clinical Infectious Disease 2001）

  41. 结 论 • 到目前为止发现的HBV耐药毒株多为低复制毒株 • 出现 YMDD突变后HBeAg阳性病例的ALT水平高于基线值； 而HBeAg阴性病例的ALT水平与基线值无差异 • 出现 YMDD突变后在个别病例可能出现肝功能失代偿 • 阐明药物诱导HBV突变确切意义，需将耐药突变体转染培养细胞系，进行体外病毒药敏实验 • 与细菌相类似，HBV可产生对LAM耐药性，一方面我们应重视LAM耐药性的监测，同时不应因耐药性的产生而否定LAM的疗效

  42. 核苷类似物抗病毒治疗认识的深化 2000 2003 第一阶段 第二阶段 第三阶段 治疗终点 清除病毒 cccDNA 完全应答 最大限度 最长时间抑制病毒 存在问题 病毒抗药 停药反跳 阿德福韦等 医患反应 ？

  43. 研 究 展 望 • 耐药突变病毒的免疫清除机制（CTL应答和细胞因子谱改变) • 联合治疗能否推迟耐药的产生 • 新核苷类似物的耐药谱

  44. 孙 剑 博士 王战会 助理研究员 陈金军 博士 钱 毅 博士 曾国兵 硕士 张明霞 主管技师 郭亚兵 副教授 英国帝国理工医大学: P Karayiannis; M Thursz, HC Thomas教授 伦敦大学 NV Naoumov 长期合作研究关系 致 谢

  45. 致 谢 感谢山东传染病院王磊教授、王耀宗教授，福州传染病院江家骥院长 感谢斯祟文教授和英国伦敦大学NV Naoumov教授为本报告提供了很好的建议。 比利时INNOGenetics 公司提供的免费INNO-Lipe probe。葛兰素威康公司授权使用LAM四年临床验证的部分结果，Gilead Science公司Shelly Xiong博士提供的部分材料。

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