filmić!

1. 1. Na donjoj slici prikazan je dio poliakrilamidnog gela za sekvenciranje metodom kontroliranog zaustavljanja replikacije (Sangerova dideoksi metoda). Odredite slijed nukleotida DNA kalupa! filmić!

2. Sanger-ova dideoksi metoda • kontrolirani prekid enzimske replikacije • DNA • ista reakcija u 4 tubice • 4 dNTPs, a u svakoj tubici po jedan 2’-3’- • dideoksi analog jednog od 4 dNTPs • ugradnja analoga blokira daljnju sintezu • jer nema 3’-OH kraj za nastanak sljedeće • fosfodiesterske veze • dobiju se fragmenti različite veličine, ali • svi iz jedne tubice su terminirani istim • analogom • npr. dATP će se ugraditi gdje je T u • komplementarnom lancu tj. onom kojem se određuje slijed • - fragmenti različite duljine odgovaraju poziciji T

3. Sekvenciranje danas: • automatizirano • fluorescentna umjesto radioaktivne detekcije • cijena: 100 kn (+ PDV)

4. Mekšanje DNA • disocijacija dvostruke zavojnice • Tm : temperatura pri kojoj je 50% dvostruke zavojnice narušeno • hipokromizam

5. 2. Genom virusa SV40 je kružna dvolančana DNA od 5243 parova baza. Zagrijava li se otopina koja sadrži intaktnu DNA virusa, primjećuje se porast apsorbancije pri 260 nm. Kada se otopina zatim hladi polagano, apsorbancija opada. Ukoliko se dvolančana DNA virusa SV40 pocijepa na jednom ili više mjesta okosnice, koju čine šećeri i fosfati, zagrijavanje također uzrokuje hiperkromni efekt. Međutim, kada se otopina u kojoj se nalazi pocijepana DNA polagano hladi, primjećuje se znatno manja redukcija u vrijednostima apsorbancije nego što je to kod otopine intaktne DNA. Zašto se te dvije otopine DNA ponašaju drukčije prilikom hlađenja? 3. Priličan broj čimbenika utječu na ponašanje linearne, dvolančane molekule DNA u 0,25 mol dm-3 otopini NaCl. Objasnite sljedeće tvrdnje: a) Tm raste s duljinom molekule DNA. b) Smanjenjem koncentracije NaCl smanjuje se i Tm. c) Tm se smanjuje kada se u otopinu doda ureja. • 4. Kako će se sljedeći postupci odraziti na Tm i krivulju mekšanja dvolančane DNA koja se nalazi u vodenoj otopini: • a) smanjenje ionske jakosti • b) protiskivanje pod pritiskom otopine DNA kroz vrlo tanku iglu • c) dodatak adenina do konačne koncentracije 0,1 mol/dm3

6. 5. Ravnotežna sedimentacija u gradijentu gustoće značajna je metoda za separaciju i karakterizaciju nukleinskih kiselina. Po toj metodi koncentrirana otopina soli teškog metala (najčešće CsCl) koja sadrži uzorak nukleinske kiseline centrifugura se pri visokoj brzini. Sol stvara linearni gradijent koncentracije u centrifugalnom polju koji varira u gustoći od 1,55 do 1,80 g/cm3. Nukleinske kiseline akumuliraju se kao oštra vrpca pri onoj gustoći gradijenta koja odgovara njihovoj gustoći. Mjerenjem gustoće u toj točki dobija se gustoća uzorka nukleinske kiseline. Vrijednost gustoće za dvolančanu DNA raste linearno s porastom sadržaja GC parova, što omogućuje da mjerenje gustoće (uz mjerenje Tm) bude metoda za određivanje nukleotidnog sastava DNA (r = 1,700 za DNA koja ima 50% GC parova). Jednolančana DNA ima 0,015g/cm3 veću gustoću od dvolančane DNA istog nukleotidnog sastava. RNA je gušća od DNA i obično pada na dno gradijenta CsCl ne formirajući vrpcu. Pretpostavite da imate nepoznati uzorak nukleinske kiseline i trebate ga okarakterizirati. Pronašli ste sljedeće: • Uzorak pokazuje oštri porast apsorbancije u ovisnosti o temperaturi i to s 30% hiperkromnim efektom. Brzim hlađenjem dolazi do malog smanjenja apsorbancije. • Nedenaturirani uzorak stvara u gradijentu gustoće CsCl jednu oštru vrpcu pri gustoći 1,770 g/cm3

7. Nakon denaturacije zagrijavanjem, brzog hlađenja i ponovnog centrifugiranja orginalna vrpca nestaje, a pojavljuje se nova, upola manje apsorpcije u UV području, pri gustoći 1,720 g/cm3. Kada se sadržaj kivete za centrifugiranje snažno promiješa i ostavi neko vrijeme na pogodnoj temperaturi za renaturaciju, nova vrpca u potpunosti nestaje i sav početni UV apsorbirajući materijal se ponovno nalazi pri gustoći od 1,770 g/cm3. • Ponovljen je postupak kao i pod c), samo je denaturacija umjesto zagrijavanjem postignuta zaluživanjem uzorka na pH 12, te nakon jednog sata neutralizacijom na pH 7. Rezultat nakon prvog centrifugiranja isti je kao i pod c), ali se postupkom koji omogućuje renaturaciju ne mijenja ni izgled, ni položaj vrpce. Koju vrstu nukleinske kiseline imate u uzorku?